Esame batteriologico Finalit Ricercare in modo rapido ed

Esame batteriologico Finalità: Ricercare in modo rapido ed accurato gli agenti responsabili di processi infettivi Identificarli e determinare la loro sensibilità agli antibiotici

normale popolazione residente opportunista patogeno

metodi rapidi di identificazione preliminare Microscopici: • esame a fresco: vetrino + coprioggetto vetrino a goccia pendente • colorazioni: Gram, Blu di metilene • inchiostro di china Immunologici: • reazione Anticorpo/Antigene Biologia Molecolare

scelta dei terreni, semina dipende dalla sede dell’infezione e dell’atteso patogeno responsabile

terreni di coltura Terreni solidi in piastra: § arricchiti § selettivi § differenziali Terreni solidi in provetta Terreni liquidi

• I terreni possono essere acquistati già pronti oppure la preparazione può avvenire in laboratorio con polveri che si trovano in commercio • Le istruzioni per la preparazione sono riportate sulla confezione o su appositi manuali per terreni particolari e più complessi 6

Substrati solidi (piastre Petri) 7

semina 1 2 4 3

• Terreni nutrienti permettono la crescita della maggior parte dei microrganismi • Terreni selettivi permettono la crescita solo di alcune specie • Terreni differenziali permettono la discriminazione di una specie dall’altra grazie ad opportuni indicatori 9

Agar Sangue • Terreno nutriente con 5 % sangue di montone • non permette la crescita di Haemophilus, Neisseria, micobatteri, Bordetella, Francisella, Legionella Streptococcus pyogenes 10

emolisi parziale, viridante a totale b

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Agar cioccolato • Terreno nutriente e selettivo con sangue di cavallo (il sangue è fatto scaldare a 80°C permettere la rottura dei globuli rossi e la liberazione nel terreno di ematina e NAD) • Permette la crescita della maggior parte dei batteri ma in particolare dell’ H. influenzae e delle Neisserie. 13

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Mc Conkey • Selettivo per enterobatteri • Sali biliari e cristalvioletto inibiscono la crescita di batteri gram positivi • Lattosio e rosso neutro consentono di differenziare gli enterobatteri fermentanti (es. E. coli) dai non fermentanti (es. Acinetobacter) 15

Enterobatteri non fermentanti Enterobatteri fermentanti 16

Agar sale-mannitolo • Selettivo/differenziale • Contiene Na. Cl, mannitolo, rosso fenolo • Utilizzato per isolare stafilococchi e streptococchi, inibisce la crescita della maggior parte degli enterobatteri. Staphylococcus aureus 17

Agar sale-mannitolo 18

Agar Thayer Martin • Terreno selettivo per Neisserie patogene • (N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. lactamica), gli altri batteri sono per la maggior parte inibiti. • Contiene vancomicina (3 mg/l), colistina (7. 5 mg/l), nystatina (12. 53 mg/l), trimetoprim (15. 3 mg/l) 19

Agar Shigella/Salmonella (XLD) • Agar selettivo/differenziale per patogeni enterici • Contiene xiloso, lisina, desossicolato. Salmonella spp. Klebsiella pneumoniae 20

Sabouraud agar • Isolamento miceti • Aggiunta di ampicillina 0. 5% e cloramfenicolo 2% • Per la differenziazione di C. albicans dalle altre specie si aggiunge inoltre fenolftaleinadifosfato 5% e verde metile 0. 5% 21

Terreni liquidi • Tioglicolato: agente riducente che allontanando l’ossigeno dal terreno soddisfa le esigenze nutritive della maggior parte dei batteri anaerobici. • Brain heart: contiene estratti di cuore, cervello, peptone, destrosio, Na. Cl. È particolarmente nutritivo per la crescita della maggior parte dei microrganismi inclusi streptococchi e pneumococchi. • Triptyc soy broth: contiene triptone, soia, Na. Cl. • Brodo selenite: contiene triptone, lattosio, selenite. È utilizzato per favorire la crescita di Shigella e Salmonella. 22

Terreni differenziali Contengono sostanze che rilevano le attività biochimiche caratteristiche dei germi (es. fermentazione, idrolisi) (A. lattosio, cromogeni). Alcuni terreni selettivi (MSA, Bile) sono anche differenziali. cromogeni

colorazioni La colorazione in batteriologia, introdotta verso la metà del XIX secolo, è stata in gran parte responsabile dei grandi progressi che si sono verificati nella microbiologia. I coloranti derivano da tre composti organici: C 6 H 5 -CH 3 toluene C 6 H 5 -OH fenolo C 6 H 5 -NH 2 anilina e sono divisi in due grandi categorie: acidi e basici, i batteri sono basofili quindi vengono usati coloranti basici

colorazioni § blu di metilene § Ziehl-Neelsen § violetto di genziana (Gram) § metacromatica

colorazione di GRAM blu / violetto gram positivi rosso gram negativi

gram positivi Bastoncini (lattobacilli)

gram positivi stafilococchi

gram positivi streptococchi

gram negativi bastoncini

antibiogramma Determinazione della sensibilità dei germi agli antibiotici ü diluizione ü in provetta diffusione in Agar (Kirby-Bauer) (metodo standard)

Mueller-Hinton agar • Estratto di carne, casaminoacidi, lievito • Utilizzato per saggiare la sensibilità dei microrganismi agli antibiotici 33

Kirby Bauer d 2 d

E-test

Metagenomics As a result, the genetic and biological diversity of microorganisms is an important area of scientific research. Unfortunately, scientists are able to grow LESS THAN 1% of all microorganisms observable in nature under standard laboratory conditions. This leaves scientists unable to study more than 99% of the biological diversity in the environment

• VBNC: attivazione di uno stato vitale ma non coltivabile • Internalizzazione: b-lattamici e aminoglicosidi non entrano all’interno delle cellule (Ig, PMN) • Induzione di forme filamentose 38 http: //www. microbiologia. unige. it/dpb/debbia. htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche

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Rappresentazione schematica della divisione di cellule bastoncellari o coccoidi I batteri si dividono per scissione binaria Il tempo di divisione (generazione) della cellula batterica è molto variabile e dipende dalla specie e dal terreno di coltura Ad es. E. coli può dividersi ogni 20 min, in una notte oltre 20 generazioni (circa 500 anni per un uomo) M. tuberculosis ha un tempo di generazione di circa 24 ore

• Durante questo periodo molti caratteri di patogenicità e virulenza e di resistenza agli antibiotici possono essere persi specie se veicolati da plasmidi 43 Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http: //www. microbiologia. unige. it/dpb/debbia. htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche

L’intenso uso di antibiotici non incide solamente sull’evoluzione delle resistenze, ma anche sulla fisiologia dei microrganismi 44

Curva di crescita di un ceppo veicolante un plasmide Il ceppo J 53 è un E. coli in grado di ospitare un plasmide (es. R 64) o altro simile ma di P. M. superiore. In ogni caso la semplice aggiunta di altro materiale genetico incide sulla velocità di crescita. D. O. Tempo 45

Ceppo selvaggio e suo derivato resistente alla rifaximina 46

Il ceppo resistente risulta subire gli stessi effetti del ceppo sensibile ma a concentrazione maggiore 47

Enterobatteri Costo biologico della resistenza Fitness batterica: concetto complesso da definire comprende molte componenti: Tasso di crescita (test COMPETIZIONE) Virulenza (test in vivo, espressione fattori di patogenicità) 48 Andersson e Levin, Curr Opin Microbiol, 1999; Andersson Curr Opin Microbiol, 2006

Enterobatteri fosfomicino-R Costo biologico ceppi mutanti di E. coli e K. pneumoniae rispetto agli isogenici: Øhanno ridotta velocità di crescita Øsono più sensibili alla fagocitosi ØModificata idrofobicità di superficie Li Pira, Pruzzo e Schito Eur. Urol, 1987 49

Conclusions Thus, reversibility studies at both the individual and community level indicate that often resistant bacteria are able to persist for a long time, even if no antibiotic selective pressure is present. Compensatory evolution, cost-free mutations and co-selection of resistance markers provide likely explanations for this poor reversibility. 50

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