Erythropotine rcepteur de lrythropotine et polyglobulies Valrie Ugo
Erythropoïétine, récepteur de l’érythropoïétine et polyglobulies Valérie Ugo Laboratoire d ’Hématologie, CHU Brest Inserm U 362, Villejuif
Erythropoïèse : Action des cytokines progéniteurs immatures BFU-Ep progéniteurs matures BFU-Em CFU-E érythroblastes immatures PE EB érythroblastes matures EP EA GM-CSF, IL 6 IL 3 SCF EPO L’érythropoïétine est la seule cytokine à agir sur l ’érythropoïèse terminale GR
Caractéristiques biochimiques de l’érythropoïétine n Masse moléculaire de la partie protéique : 18 400 Da n Masse moléculaire de la protéine glycosylée : 30 400 Da n Glycosylation nécessaire à l’activité biologique in vivo
Synthèse de l’EPO Cellules productrices - Rein adulte n Cellules péritubulaires interstitielles, d’origine fibroblastique Maxwell, 1993 n Cellules tubulaires Maxwell, 1990 Loya, 1994 n En pathologie · Rein polykystique : cellules péritubulaires Eckardt, 1989 · Cancer du rein : cellules d’origine tubulaire Da silva, 1990
Synthèse de l’EPO Foie adulte § Hépatocytes + autre cellule ? Koury S. T. 1991 Schuster S. J. 1992 § Hépatocytes + cellules de ITO Maxwell P. H. 1994
Régulation de la production d’Epo Lignée-Erythroblastique Cellule Souche GR Circulant Erythropoïetine Consommation O 2 Vaisseaux Rein PO 2 Cœur Poumons Air inspiré O 2 Régulation de la production d’Erythropoïetine par le rein
Relation entre hématocrite et taux sérique d’EPO Epo sérique, m. U/m. L 5000 100 Réponse Epo appropriée 10 15 Réponse Epo inappropriée 20 25 30 Hématocrite, % 35 40 D’après M. Cazzola, Blood 1997
Sécrétion d’érythropoïétine en réponse à l’anémie Erythropoïétine UI/L 300 Carence martiale Anémie IRC 250 200 150 100 50 0 6 7 8 9 10 Hémoglobine (g/dl) 11 12
Récepteurs à l’érythropoïétine expression ¨ Erythroblastes - Normaux - Lignées ¨ Mégacaryocytes ¨ Placenta ¨ Cellules endothéliales ¨ Astrocytes - neurones
Erythropoïèse: marqueurs de différenciation Erythropoïèse précoce BFU-Ep BFU-Em CFU-E Erythropoïèse tardive PE EB EP EA CD 34 c-kit CD 71 CD 36 GPA Hémoglobine Récepteur de l ’EPO GR
Structure générale des récepteurs de cytokines Domaine extracellulaire N Domaine cytokine Membrane cellulaire 1 seul domaine TM (peut être absent) Domaine intracellulaire C Partie intracellulaire sans activité catalytique propre
Récepteur de l’érythropoïétine N-term n n + n n - cloné en 1989 chromosome 19 5 kb, 8 exons protéine 508 aa 55 à 72 -78 k. Da exons 7 et 8 du gène : partie intracytoplasmique C-term D’Andrea et al, 1989
Récepteur de l’Epo Vav Myc IRS-2 B 1 Jak 2 association and activation B 2 Stat 5 GAB 1/2 Y 343 LVLD Y 1 Y 401 TILD Y 2 Y 429 LYLV Y 431 LVVS Y 3 Y 443 SSGG Y 5 Y 460 SHPY Y 6 Y 464 ENSL Y 7 Grb 2 Y 479 VACS Y 8 PI 3 -kinase Stat 5, GAB 1/2 SHP-2, Cis Stat 5 (+/-) SHP-1 Stat 5 (+/-)
Mécanisme d ’activation de R-EPO Epo Epo P Relais intracellulaires STAT 5 PI 3 -kinase Ras/MAP kinases Epo P P P
Représentation des mécanismes de survie, de prolifération, et de différenciation induits par l'EPO R-EPO JAK 2 ? SHP-1 GATA-1 Pi 3 -K STAT 5 PKC SOCS-3 Bcl-XL Différenciation érythroïde AKT MAP-K Anti-apoptose Prolifération? ? Anti-apoptose Différenciation? Cycle cellulaire Prolifération
Anomalies du récepteur de l’EPO Modèles expérimentaux N-term n R 129 C + - n mutation ponctuelle : arginine cystéïne (codon 129) ==> autonomie de croissance et tumorigénicité délétion de l'extrémité C-terminale chez la souris ==> augmentation d'activité de R-EPO C-term Yoshimura, 1990, D'Andrea, 1991
Polyglobulies ou érythrocytoses sporadiques Vaquez secondaires acquises EPO normale ou basse congénitales familiales R-EPO VHL EPO sérique élevée primitives PFCP IRC, tumeurs Hb anormales
Le récepteur de l’EPO est normal dans la maladie de Vaquez n Observation de colonies spontanées ou endogènes en absence d'érythropoiétine (EEC) n Pas d'anomalie de l’affinité du récepteur de l’EPO n Pas de mutation du gène du récepteur à l'EPO n Pas de stimulation autocrine par l’EPO · pas de détection de transcrit de l’EPO dans la moelle des patients, ni dans les colonies d’érythroblastes obtenues in vitro. · des anticorps anti-EPO ne bloquent pas la prolifération spontanée Means, 1989, Fischer, 1994, Le Couédic, 1996
Polyglobulies primitives Formation des colonies érythroïdes in vitro EEC
Polyglobulie familiale et mutation du gène de REPO § Etude de trois familles polyglobuliques : pas d'anomalie de REPO en Southern blot (Emanuel, 1992) n n n 1ère description d'une famille avec 33 membres atteints (De la Chapelle, 1993) Propositus : champion du monde de ski de fond 5 générations étudiées transmission autosomique dominante Espérance de vie normale, aucun symptôme
Polyglobulie familiale Caractéristiques des sujets polyglobuliques De La Chapelle, 1993 n Hb moyenne H = 20, 4 g/dl F = 19, 1 g/dl n Hypersensibilité à l'EPO des progéniteurs médullaires (10 -2) n Pas d'autonomie vraie n Pas de stimulation des progéniteurs par le sérum des patients
Mutation du gène de R-EPO Délétion de l’extrémité C-terminale De La Chapelle, 1993 N-term n Etude du gène de R-EPO · mutation G 6002 A (exon 8) · TGG (tryptophane) en TAG (codon stop) · + · n - C-term récepteur « tronqué » de 70 aa à l'extrémité C-term mutation présente 29 cas/29 étudiés Hétérozygotes
La délétion de l’extrémité C-terminale entraîne la perte du site de fixation de SHP-1 n JAK 2 n STAT 5 n SHP-1 Transfection de R-EPO tronqué dans Ba/F 3 confère hypersensibilité à l'Epo (De La Chapelle, 1993) Présence des 2 types de transcrits dans les progéniteurs (Sokol, 1995) Diminution du taux d'inactivation de Stat 5 et de Jak 2 (Arcasoy, 1999)
Polyglobulies familiales et congénitales primitives (PFCP) n masse sanguine avec érythrocytose pure n aucun critère de PV : GB et plaq N, pas de SPM n pas d'évolution leucémique n Hb et Ht remarquablement stables n absence de cause secondaire, taux d'EPO Nl ou bas n affinité de l'Hb pour l'O 2 Nle n hypersensibilité à l'Epo des progéniteurs maladie extrêmement rare (incidence ? ) transmission autosomique dominante rares cas sporadiques, ou à trans. autos. récessive
Mutations de R-EPO et polyglobulie familiale : Données de la littérature Delachapelle, 1993 F G 6002 A perte 70 aa Sokol, 1995 F 5974 ins. G perte 64 aa Furukawa, 1997 F C 5986 T perte 74 aa Arcasoy, 1997 F del 7 pb 5985 -5991 perte 59 aa Kralovics, 1997 F del 7 pb 5985 -5991 perte 59 aa F 5967 ins. T perte 65 aa Percy, 1998 S G 6002 A perte 70 aa Kralovics, 1998 F C 5964 G perte 83 aa Watowich, 1999 F dupl 5968 -5975 perte 79 aa Kralovics, 2001 F G 5959 T perte 84 aa Arcasoy, 2002 F G 5881 T perte 110 aa Ugo, 2004 F del 2 pb 5857 -5858 perte 85 aa Petersen, 2004 F del 4 pb 5938 -5941 perte 58 aa
Mutations de R-EPO et polyglobulies Remarques n n n 1 enfant porteur de la mutation, hypersensibilité des progéniteurs érythroïdes mais pas de polyglobulie (Kralovics, 1998) Cas sporadiques de mutation ponctuelle C 6148 T (P 488 S) effet ? (Sokol, 1994 ; Le Couédic, 1996) Mutation intronique de signification inconnue (Kralovics, 2001)
Erythropoietin receptor mutations and Olympic glory n Existe-t-il un lien entre le taux d'Hb et la performance sportive ? n Risque d'incitation au dopage n n Existe-t-il une diminution de l'espérance de vie des patients REPO muté ? · risque d'affections myocardiques · hémorragies / ischémies cérébrales Effets extra-hématopoïétiques des mutations de R-EPO ? Longmore, Nat Genet 1993 ; Prchal, Science 1995
Polyglobulie et mutation de R-EPO Modèles animaux (1) n Remplacement (knock-in) du R-EPO murin par le récepteur humain sauvage et muté (C 5964 G) n C 5964 G récepteur amputé de 83 aa en C-term n souris wt / hm polyglobuliques, Ht 55% hypersensibilité in vitro des progéniteurs n souris hm / hm viables sévèrement polyglobuliques, Ht > 60% splénomégalie Divoky et al, 2001
Mutation de R-EPO Modèles animaux (2) n Délétion de 108 aa n Souris viables n Hétérozygotes : pas d'érythrocytose, Ht normal n Homozygotes n · Taux d’Hb = 1, 08 x · Légère du nb de CFU-E dans la moelle · activation STAT 5 en réponse à l’EPO Idem + mutation Y 343 · Phénotype similaire aux souris STAT 5 a/b -/- · Sauf splénomégalie Zang et al, 2001
Modèles animaux : discordances Vav Myc IRS-2 Délétion 108 aa Non polyglobuliques Délétion 83 aa Polyglobuliques B 1 B 2 Y 343 Y 1 Y 401 Y 2 Y 429 Y 431 Y 3 Y 443 Y 460 Y 464 Y 5 Y 6 Y 7 Y 479 Y 8 Jak 2 association and activation Stat 5 GAB 1/2 Stat 5, GAB 1/2 SHP-2, CIS, SOCS 3 Stat 5 (+/-) SHP-1 Stat 5 (+/-) Canonical Grb 2 binding site PI 3 -kinase
Inhibition de la transduction du signal par les SOCS (suppressors of cytokine signaling) n Différents modes d’action moléculaires n Se fixent aux JAKs et/ou sur EPO-R n Et inhibent leur activité catalytique en agissant comme pseudo-substrat n Mécanisme de compétition CIS - STAT 5 (Y 401) ? n Puis dégradation des protéines du signal par le protéasome ubiquitination JAK SOCS 1 SOCS 3 P CIS STAT P protéasome Cullin-2 JAK Elongin BC STAT SH 2 SOCS box
Souris SOCS 3 -/Résultats discordants n n Phénotype létal à J 12 -16 · Erythrocytose marquée · nb de prog érythro du foie · de la x° in vitro des progéniteurs érythroïdes Les cellules SOCS 3 -/- reconstituent des souris létalement irradiées · du nb de progéniteurs · de la réponse à l'epo ( taille des colonies) Marine, 1999 n n n Phénotype létal à J 11, 5 -13, 5 · Anomalies placentaires trophoblaste, labyrinthe plac ==> insuffisance placentaire · Petite taille des embryons, hypocellularité globale Pas d'érythrocytose Pas d'anomalie des progéniteurs érythroïdes (nb, taille des colonies, réponse à l'epo) Roberts, 2001
Mutations de R-EPO et polyglobulies Remarques et questions non résolues n n Physiopathologie peu claire Polyglobulies non malignes familiales et congénitales : rares mais incidence mal connue Importance du recensement des cas 12% avec mutation R-EPO Autres mutations? Existe-t-il une diminution de l'espérance de vie des patients R-EPO muté? Proposition de suivi médical spécialisé risque d'affections myocardiques hémorragies / ischémies cérébrales Mutations - perte de fonction ? anémies ou dysérythropoièses congénitales ?
CHU Brest Hôtel Dieu, Paris Laboratoire d’Hématologie Valérie Ugo Nicole Casadevall Hôpital Henri Mondor, Créteil Laboratoire des Hémoglobines Inserm U 468 Claude Préhu Frédéric Galactéros
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