EnzymeLinked Immunosorbent Assay ELISA 1959Berson and Yellow Radioimmunoassay
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay 免 疫 酵 素 連 結 反 應
ELISA的起源 • 1959年由Berson and Yellow基於生物分子抗原 性,利用抗原抗體反應的專一性和高靈敏度來作 生物分子的定量,並提出放射免疫分析(Radioimmunoassay, RIA)技術與理論。 Berson SA and Yellow RS Quantitative Aspect of the Reaction Between Insulin and Insulin Binding Antibody. J Clin Invest 1959; 38: 1996 -2016. • 1967年Catt和Tregear等人首先提出以抗體吸附 在塑膠管內壁來進行固定相放射免疫分析的理論, 以便游離態與結合態的分離。 Catt K and Tregear GW Solid-Phase Radioimmunoassay In Antibody Coated Tubes. Science 1967; 158: 1570 -1572.
小分子抗原的製備 • 載體的選擇 – Bovine Serum Albumin, Human Serum Albumin, Ovalbumin, Keyhole Limipt Hemocyanine等。 • 螯合方法 • 去除未結合部份 – 透析
螯合方法 Conjugate Method • Glutaraldehyde (GA) Method • Carbodiimide (CD) Method • Mixed Anhydride Method
Conjugate Method Type of Bond Reactive group in hapten utilized for coupling R 1 -NHCH(OH)(CH 2)3 CH(OH)N H-R 2 -NH 2 or -COOH Carbodiimide Method R 1 -CONH-R 2 -NH 2 or -COOH Mixed Anhydride Method R 1 -CONH-R 2 -NH 2 or -COOH Glutaraldehyde Method
4 3 2 1 3 1 2 4 Adapted from Milstein (1980) Scientific American, Oct. p. 58 31 2 4
31 2 4 單株抗體 1 1 2 3 4 + m m 2 3 4
ELISA的原理 固相免疫分析 • 固定相種類 – 微滴定盤(microtiter plate) – 亞硝基樹脂(nitrocellulose) – 耐龍薄膜(nylon membrane), cellulose nitrate ester (nitrocellulose; NC), polyvinylidene difluoride (PVDF) – 聚苯乙�球(polystyrene bead)及微粒子 (microparticle)
ELISA酵素呈色系統 • Horseradish Peroxidase • Alkaline Phosphatase • beta- galactosidase • Glucose Oxidase • Glucose-6 -phosphate Dehydrogenase
酵素 vs. 受質 • HRP – OPD O-phenylenediamine – ABTS 2, 2'-azino-di-(3 -ethylbenziazobine sulfonate-6) – HPPA 3 -(4 -hydroxy)phenly propionic acid – TMB 3, 3’, 5, 5 -Tetramethylbenzidine • ALP – p-NPP p-nitrophenyl phosphate – Phosphate 4 -mehtylumbelliferone • beta- galactosidase – 4 -mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside
ELISA實施方式 • 直接ELISA – One-Step • 間接ELISA – Two-Step • 三明治ELISA – Sandwich ELISA
直接ELISA
直接ELISA
間接ELISA
三明治ELISA
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