Enzimi Proteine che agiscono da catalizzatori biologici aumentando

Enzimi

“Proteine che agiscono da catalizzatori biologici aumentando enormemente la velocità delle reazioni biochimiche”

PROPRIETÀ DEGLI ENZIMI Alta specificità dotati di elevatissimo grado di specificità, maggiore di qualunque catalizzatore chimico Alta velocità di reazione aumentano reazione fino a 1012 enzimi la velocità di volte rispetto alla stessa reazione non catalizzata da Capacità di regolazione inibizione a feedback, controllo allosterico, modificazione covalente, variazioni della quantità di enzima Agiscono in condizioni moderate temperature inferiori a 100 °C, pressione atmosferica, p. H neutro Catalizzatori in grado di catalizzare molte volte la stessa reazione senza produrre sottoprodotti indesiderati

Sintesi proteica Zimogeno (precursore) Apoenzima (parte proteica) gruppo prostetico (legato covalentemente OLOENZIMA Apoenzima (inattivo) ione metallico coenzima (vitamina)

Coenzimi Coenzima Precursore Biocitina Biotina 5‘-Deossiadenosilcobalamina Vitamina B 12 Flavin adenin dinucleotide Riboflavina (B 2) Acido lipoico Nicotinamide adenin dinucleotide Ac. Nicotinico Piridossal fosfato Piridossina (B 6) Tetraidrofolato Folato Tiamin pirofosfato Tiamina (B 1)

Elementi inorganici che servono come cofattori di enzimi Cu 2+ Citocromo ossidasi Fe 2+ o Fe 3+ Catalasi, perossidasi K+ Piruvato cinasi Mg 2+ Esochinasi, glucosio-6 -fosfatasi Mn 2+ Arginasi Mo Dinitrogenasi Ni 2+ Ureasi Se Glutatione perossidasi Zn 2+ Anidrasi carbonica, alcool deidrogenasi

Velocità delle reazioni X+Y Z La velocità di una reazione varia con la temperatura secondo l’equazione di Arrehenius: Velocità = Ae - Ea/RT Dove A è la costante nota come fattore pre-esponenziale, correlata alla frequenza con cui le molecole si urtano con il giusto orientamento ed alla probabilità che la collisione avvenga con un’energia sufficiente a far avvenire la reazione, Ea rappresenta l’energia di attivazione (J mol-1), R la costante dei gas (J mol-1 K-1) e T la temperatura assoluta

La conversione S --> P è termodinamicamente favorevole (P si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a S), ma la reazione non può avvenire se S non acquisisce sufficiente energia per superare la barriera dell’energia di attivazione Energia Stato di transizione S ENERGIA DI ATTIVAZIONE Ea P Coordinte di reazione

Come agiscono gli enzimi? Si combinano transientemente con il substrato e ne abbassano l’energia di attivazione Non spostano l’equilibrio della reazione, ma aumentano la velocità con cui l’equilibrio viene raggiunto Non subiscono modificazioni permanenti durante la reazione e sono subito disponibili per catalizzare una nuovo ciclo di reazione

Distribuzione delle energie cinetiche Numero di molecole Molecole con valori medi di energia Molecole che possiedono energia sufficiente per reagire in una reazione catalizzata da un enzima Molecole che possiedono energia sufficiente per reagire in una reazione non catalizzata Energia cinetica delle molecole

Reazione non catalizzata S P Reazione catalizzata da un enzima E+S ES EP E+ P

Profilo energetico di una reazione catalizzata da un enzima Stato di transizione Energia Eatt (non enzimatica) Stato di transizione Eatt (enzimatica) E+S Stato di transizione ES E+P EP Coordinate di reazione ΔG°

Misura dell’attività enzimatica Mi permette di determinare la quantità di enzima presente in un campione Solitamente si sfrutta la proprietà intrinseca dell’enzima di catalizzare una reazione

Supponiamo di voler determinare la quantità di Lattico deidrogenasi (LDH) presente nel sangue di un paziente Piruvato + NADH Lattato + NAD+ ABS 340 nm NADH NAD+ Lunghezza d’onda

Preparazione test Tampone Substrato Miscela tampone-substrato Cuvetta (quarzovetro-plastica)

Scelta della lunghezza d’onda 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 START STOP

Spettrofotometro 340 nm 0. 000 ABS 2. 000 Lunghezza d’onda 1. 000 0 1 minuti 2

Spettrofotometro Posizionamento della cuvetta nello spettrofotometro

ABS 340 nm 1. 546 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 546 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 546 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 546 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 546 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 546 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 546 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 546 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 546 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 546 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 546 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 546 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 546 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

Aggiunta dell’enzima (cofattore o substrato) Rapido mescolamento

ABS 340 nm 1. 546 2. 000 1. 000 0 1 2 minuti Inizia la reazione enzimatica

ABS 340 nm 1. 516 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 493 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 479 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 449 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 411 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 390 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 343 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 317 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 289 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 274 2. 000 1. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 245 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 224 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 189 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 156 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 123 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 098 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 053 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 1. 012 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 994 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 964 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 938 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 910 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 889 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 868 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 861 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 844 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 821 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 803 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 789 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 777 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 759 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 719 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 690 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 657 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 634 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 611 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 592 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 558 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 528 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 499 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 459 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 425 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 399 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 384 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

ABS 340 nm 0. 380 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 2 minuti La registrazione viene bloccata

Determinazione dell’attività enzimatica ABS 340 nm 0. 380 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 minuti 2

Occorre calcolare la velocità della reazione Se vengono rispettate determinate condizioni, la velocità della reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione di enzima ?

In condizioni di stato stazionario E+S k 1 >> k 2 k 1 ≥ k 3 k 1 k 2 ES k 3 E+P Velocità= k 3[ES] se la concentrazione di substrato è sufficientemente elevata [E] [ES]

In condizioni di stato stazionario E+S k 1 >> k 2 k 1 ≥ k 3 k 1 k 2 ES k 3 E+P Fino a quando [E] >>[S] V = costante V = k 3[ES] [E]

Andamento della velocità iniziale in funzione della concentrazione di substrato Vo V max • • • • L’equazione matematica che esprime la relazione iperbolica tra la velocità iniziale e la concentrazione del substrato viene detta equazione di Michaelis-Menten ½ Vmax Km [S] v= Vmax [S] Km [S]

Determinazione dell’attività enzimatica ABS 340 nm 2. 000 1. 000 0. 380 Pendenza A/min 0 1 minuti 2

Determinazione dell’attività enzimatica ABS 340 nm 2. 000 1. 000 0. 380 Velocità costante 0 1 minuti 2

In condizioni di [S] saturanti ABS 340 nm 0. 380 2. 000 1. 000 0. 000 0 1 La velocità della reazione non aumenta all’aumentare della concentrazione di substrato 2 minuti In tali condizioni la velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione di enzima

Determinazione dell’attività enzimatica Variazione di assorbimento Unità enzimatiche UI = Coefficiente di estinzione (m. M o M) del substrato Volume totale test A Vtot d Cammino ottico t Vc Tempo Volume enzima

L’attività di un enzima viene misurata in termini di “Unità enzimatiche” o “Unità Internazionali” “Unità enzimatica” Quantità di enzima capace di trasformare una micromole ( mole) di substrato in un minuto per ml di soluzione

In condizioni di [S] saturanti Velocità 1 unità di enzima 2 unità di enzima 3 unità di enzima Tempo Incrementando la concentrazione di enzima aumenta la pendenza della retta

Metodi Continuo A tempo fisso L’operatore segue la reazione “in tempo reale”: è possibile capire se stiamo eseguendo effettivamente una misura di velocità iniziale la velocità enzimatica deve rimanere costante. In tali condizioni la velocità di reazione risulta direttamente proporzionale alla concentrazione dell’enzima da misurare L’operatore fa partire la reazione e la blocca dopo un periodo di incubazione prescelto è essenziale che durante tale periodo la reazione sia di ordine zero relativamente alla concentrazione del substrato e la velocità enzimatica sia quindi sempre massima

ABS Continuo v 0 Tempo ABS Problemi di mescolamento, effetto diluizione…. v 0 Tempo Soluzione concentrata di enzima

A tempo fisso v 0 ABS STOP v 0 Tempo STOP Elevata concentrazione di enzima v 0 Tempo Campione non mescolato, precipitato…. .

Tipologia di analisi Test semplice: Test accoppiato: Nella soluzione di reazione è presente un solo enzima. La reazione può essere seguita monitorizzando la scomparsa del substrato, la formazione del prodotto, le variazioni spettroscopiche di qualche coenzima (NADH, NADPH per esempio) Si rende necessario quando nessuno dei composti che prendono parte o si formano nella reazione enzimatica può essere sfruttato per seguire l’andamento della reazione. Occorre accoppiare la reazione “primaria” con una seconda reazione definita “indicatrice”

Test ottico semplice (test di Warburg) deidrogenasi A + NADH + H+ B + NAD+ ABS 340 nm NADH o NADPH NAD+ o NADP+ Lunghezza d’onda

Test ottico accoppiato A+B enzima C+D deidrogenasi D + NADH + H+ E + NAD+ creatinfosfocinasi Creatinfosfato+ ADP Acido piruvico + ATP esocinasi Glucosio + ATP Glucosio-6 -P + NADP+ Glucosio-6 -P deidrogenasi Glucosio-6 -P + ADP Acido lattico + NADPH + H+

Per effettuare un dosaggio enzimatico in maniera corretta occorre: Uniformare la temperatura (30°C) Scegliere il valore di p. H ottimale Escludere la presenza di inibitori (reversibili o irreversibili)