Enzimas Determinacin de su actividad cataltica en distintos

Enzimas Determinación de su actividad catalítica en distintos materiales biológicos

¿Qué son ? La mayoría son proteínas ( existe ARN catalítico ). ¿ que función cumplen? Catalizadores biológicos Sus propiedades son…. -elevada especificidad. -aceleran más rápido las reacciones químicas. -no se modifica en la catálisis. -están sujetas a controles celulares, genéticos y alostèricos. -son termolábiles y sensibles a cambios de p. H.

Modelos de acción Modelo llave y cerradura: rigidez. Modelo de ajuste inducido: flexibilidad.

TRABAJO PRÁCTICO OBJETIVO Identificar las enzimas mediante su actividad, frente a sustratos específicos

Preparar 3 tubos de ensayo: Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Leche entera 10 ml Pancreatina 1 ml (hervida) 1 ml Rojo Fenol 10 gotas Incubación 37°C si si no

Sacarasa: enzima hidrolasa cataliza hidrólisis de sacarosa

Extracción de sacarasa a partir de levadura

Preparar 3 tubos de ensayo: Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Agua destilada 1 ml --- Sol. Enzima 1 ml --- 1 ml Sacarosa 1% --- 1 ml 30 minutos Incubación 37°C 30 minutos

sacarasa con sacarasa

Amilasa salival: Hidrolasa segregada por las glándulas salivales Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Saliva 1: 9 1 ml Almidón 1% 5 ml Temperatura 0°C 37°C Tiempo 10 min. Reacción Lugol Fehling

Amilasa pancreática: Hidrolasa liberada por el páncreas Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Pancreatina 2% 1, 5 ml --- Almidón 1% 1, 5 ml Temperatura 37°C Tiempo 10 min. Reacción Lugol Fehling

Transaminasas GOT B 6 GPT: glutámico pirúvico transaminasa, alanin amino transferasa o ALAT GOT: glutámico oxalacético transaminasa, aspartato amino transferasa o ASAT

Transaminasas GOT GPT Sustrato ml 0, 5 Homog. Hervido ---- 0, 5 0, 5 5 5 Homog. Sin herv 0, 5 Incubar 30´ 37°C 2, 4 DNFH ml Incubar 10´ 37°C Na. OH 0, 4 M ml

Cinética enzimática

El estudio de una enzima en un medio biológico involucra 2 análisis: 1 - detección de la enzima: estudio cualitativo. 2 - concentración de la enzima: estudio cuantitativo. Para la detección de la enzima se evalúa la reacción química que cataliza específicamente, observando la desaparición de los reactivos o la aparición de los productos. La cinética química estudia la velocidad de transformación de los reactivos en productos.

La velocidad se expresa en términos del cambio en la concentración de sustrato o producto por unidad de tiempo A V= + B ----- C + D - d. A dt o d. C dt La velocidad de reacción depende de: p. H Temperatura Concentración de reactantes. Presión Presencia de catalizadores: enzimas = K. [A]. [B]

Unidades de Actividad enzimática: Actividad que transforma 1 umol de sustrato por minuto a temperatura y presión dados. Katal: Transformación de 1 mol de sustrato/ seg

Ecuación de Michaelis Menten La forma característica de la curva de saturación de la enzima por el sustrato se expresa matemáticamente por la ecuación: v = Vmax[S] Km + [S] k 1 E+S ES k-1 k 2 E+P Km concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es ½ de su velocidad máxima Km = k-1 + k 2 k 1

En las reacciones enzimáticas en que participan más de un sustrato, cada uno de ellos posee su propia Km La Km representa una medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato. Cuanto mayor es el valor de Km menor será la afinidad de la enzima por el sustrato.

La forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten se conoce como gráfica de los dobles recíprocos o de Lineweaver-Burk y se utiliza para el cálculo de los parámetros cinéticos Km y Vmáx. v 0 = 1 = v 0 Vmax[S] Km + [S] Vmax[S] Km [S] 1 = + v 0 Vmax[S] Km 1 1 1 = + v 0 Vmax [S] Vmax Ecuación de Lineweaver-Burk

Inhibición competitiva El inhibidor y el sustrato compiten por el mismo centro activo de la enzima Similitud estructural con el sustrato Al aumentar la concentración de sustrato se desplaza al inhibidor

La velocidad máxima permanece constante El valor de Km aumenta

Inhibición no competitiva El inhibidor se une en un sitio diferente al sitio activo de la enzima de manera que se puede unir a la enzima o al complejo ES pero en ninguno de los casos obtendremos productos. No se revierte por agregado de más sustrato

Objetivos del Trabajo Práctico: Seleccionar las condiciones para estudiar la cinética de una reacción enzimática. Determinar Km y Vmax de la reacción de hidrólisis enzimática de la sacarosa.

La sacarasa cataliza la hidrólisis de la sacarosa en glucosa y fructosa. Velocidad = se expresa como concentración de sustrato hidrolizado por minuto. Para conocer la concentración de sacarosa hidrolizada mediremos la concentración de glucosa liberada.

0, 1 g de levadura + 25 ml de sol. EDTA 1% Centrifugar homogenato 5 min. a 3. 000 rpm Sobrenadante: extracto enzimático

Tubo Enzima Ac. Na EDTA (ml) SACAROSA ml 0, 2 M Blanco 0, 15 M 0, 1 M 0, 05 M 0, 025 M 0, 01 M ------ 1, 5 --- --- --- 1 0, 5 1, 5 --- 1 --- --- --- 2 0, 5 1, 5 --- 1 --- --- 3 0, 5 1, 5 --- --- 1 --- --- 4 0, 5 1, 5 --- --- 1 --- 5 0, 5 1, 5 --- --- --- 1 --- 6 0, 5 1, 5 --- --- --- 1 Ac. Na: buffer acetato de sodio 0, 1 M p. H 4, 7 Dejar los tubos 10 minutos a 25 °C.

A los tubos del experimento anterior y luego de la incubación: Blanco testigo 1 2 3 4 5 6 Glucosa 1 g/l --- 20 ul --- --- --- Reactivo trabajo 2 ml 2 ml Incubar en baño a 37°C por 15 minutos Leer a 505 nm llevando a 0 con el blanco Calcular concentración de glucosa en cada tubo comparando con el testigo.

Fundamento del método GOD Glucosa + O 2 + H 2 O --------- ácido glucónico + H 2 O 2 POD 2 H 2 O 2 + fenol + 4 AF -------- quinoneimina + 4 H 2 O Quinoneimina es un cromógeno rojo cereza con un pico máximo de absorción a 505 nm. El reactivo de trabajo es una mezcla de las enzimas GOD y POD, 4 - aminofenazona y fenol en buffer fosfato p. H 7.

Calcular la concentración de glucosa en cada tubo en g/l y en M. Calcular g de glucosa en 3 ml que tiene cada tubo. Calcular moles de glucosa / minuto mol / min Glucosa velocidad moles sacarosa [S] CALCULAR GRAFICAMENTE Km y V max

45. 000 40. 000 35. 000 1/V 30. 000 25. 000 20. 000 R 2 = 0. 9976 15. 000 10. 000 5. 000 0. 05 0. 10 0. 15 0. 20 0. 25 1/[S] 0. 30 0. 35 0. 40 0. 45

0. 400 0. 350 0. 300 V 0. 250 0. 200 0. 150 0. 100 Vel. , sin inhibidor Vel. , con inhibidor 0. 050 0. 000 0 0. 05 0. 1 [S] 0. 15 0. 2

10 9 V 8 7 6 5 Vel. , sin inhibidor (mmol min -1) 4 3 Vel. , con inhibidor (mmol min-1) 2 1 0 0 5 10 [S] 15