Enzimas Curvas temporales de actividad enzimtica de LDH
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Enzimas Curvas temporales de actividad enzimática de LDH
Proteínas
LDH (EC 1. 1. 1. 27). Enzima importante en el metabolismo anaerobio de la glucosa para la regeneración de ATP. El piruvato es reducido a lactato gracias a la oxidación de NADH a NAD+
Función de las proteínas Centro de acción en procesos biológicos. • Catalizan el conjunto de reacciones químicas a las que de manera general nos referimos como vida. • Regulan: directamente como enzimas o indirectamente en forma de mensajeros químicos (hormonas, receptores, transportadores). • Dan soporte: fibras musculares, micro fibrillas en ciclo celular, etc. • En defensa: anticuerpos (inmunoglobulinas). • Papel pasivo: colágeno en huesos, tendones, ligamentos.
Proteínas Estructural: relaciones en el espacio (3 D) entre los componentes atómicos de una proteína: • Estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. • Grupos prostéticos • Modificaciones covalentes
Catalizador Molécula inorgánica u orgánica que incrementa importantemente la velocidad de una reacción química sin ser modificada o consumida en la reacción.
Enzimas Son catalizadores biológicos: disminuyen la energía de activación de las reacciones que catalizan, pero NO modifican la constante de equilibrio. • Ej. Constante de equilibrio de una reacción: Keq = K 1 K-1 = 10 -3 10 -5 = 100 Reacción catalizada por una enzima acelera la reacción 10, 000 veces Keq = K 1 K-1 = 10 10 -2 = 100
Ejemplo La reacción en que una molecula de orotidina monofosfato pierde un CO 2 ocurre 1017 veces más rápida cuando es catalizada por la enzima orotidina monofosfato descarboxilasa que cuando no es catalizada. 1017 = 100, 000, 000 ¡CIEN MIL BILLONES DE VECES MÁS RÁPIDA!
Ventajas de enzimas sobre catalizadores inorgánicos • EFICIENCIA Velocidades de reacción elevadas • CONDICIONES SUAVES DE REACCIÓN Temperatura, p. H, presión • ESPECIFICIDAD DE LA REACCIÓN Unión a sustrato • CAPACIDAD DE REGULACIÓN Control alostérico, modificación covalente, Síntesisdegradación
Reacción química vs Reacción catalizada por enzima Anaerobiosis, en nódulos de fijación.
Sitio catalítico o sitio activo Región tridimensional de la proteína que une específicamente al sustrato, por reconocimiento estructural complementario. Contiene a los grupos catalíticos y los cofactores/coenzimas.
La catálisis enzimática requiere: • - Unión específica de la proteína al sustrato y a moléculas reguladoras. • - Reactividad específica de la proteína con su sustrato.
Dos teorias para explicar la unión específica enzima-sustrato: – TEORÍA DE LA LLAVE Y LA CERRADURA – TEORÍA DEL AJUSTE INDUCIDO
TEORÍA DE LA LLAVE Y LA CERRADURA E. Fisher, 1894 La enzima tiene un sitio (sitio activo) en el que “encaja” perfectamente el sustrato, al unirse ambos se lleva a cabo la catálisis Estampado molecular
TEORÍA DEL AJUSTE INDUCIDO D. Koshland, 1958 La unión del sustrato al sitio activo de la enzima promueve un cambio conformacional de la enzima para que al unirse ambos se lleve a cabo la catálisis
CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS En general, los nombres de las enzimas se forman añadiendo el sufijo “asa” al nombre de la sustancia en la que actúan
Enzyme Commission Number
En algunas reacciones enzimáticas es necesaria la presencia de cofactores o coenzimas para llevar a cabo la catálisis. Iones metálicos como Fe 2+, Zn 2+, Mg 2+ Coenzimas Moléculas orgánicas Flavin mononucleótido o FMN Flavin adenin dinucleótido o FAD+, Nicotin amida adenin dinucleótido o NAD+ Nicotin amida adenin dinucleótido fosfato o NADP+ Grupo prostético Asociado de modo permanente a la enzima. Sitio activo de la enolasa que utiliza Mg 2+ como cofactor
Las enzimas disminuyen la energía de activación de las reacciones que catalizan
Cinética enzimática Estudio de la velocidad a la cual se lleva a cabo una reacción catalizada por una enzima y de los factores que la afectan.
Actividad enzimática = Velocidad = Actividad enzimática: la cantidad de sustrato desaparecido o producto formado por unidad de tiempo. Por tanto sus unidades son cantidad de producto o sustrato por unidad de tiempo moles µmoles nmoles gramos miligramos µgramos Hora Minuto Segundo
Progreso de la reacción enzimática Fase de pre estado estacionario (mseg) Estado estacionario Es aquel en que la concentración del complejo ES permanece constante
El patrón hiperbólico de velocidad de una enzima vs la concentración de sustrato se describe en el modelo de Michaelis. Menten
Condiciones en las que aplica la ecuación de Michaelis-Menten Velocidad inicial [producto] en medio de ensayo al mínimo [sustrato] muy superiores a la concentración de la enzima La concentración de sustrato debe permanecer “casi” constante durante el periodo de tiempo en que se mide la reacción
Velocidad inicial La velocidad de una rxn (no orden cero) disminuye a medida que ésta progresa ya que la concentración del reactante(s) disminuye, y porque si la reacción es reversible inicia la reacción inversa. • • Velocidad inicial (v 0) de la rxn: la velocidad antes de que la concentración de los reactantes disminuya significativamente y que los productos alcancen una concentración que produzca una reacción inversa significativa. • En las reacciones catalizadas por enzimas, dos razones que hacen conveniente medir velocidades iniciales: 1) el producto puede ser un inhibidor de la reacción, aún cuando la reacción no sea reversible. 2) la enzima puede ser inestable en el medio de reacción.
Parámetros cinéticos Velocidad máxima
Constante de Michaelis-Menten (Km) La Km corresponde a la conc. de sustrato a la cual la velocidad es = Vmax/2 Es un parámetro de afinidad de la enzima por el sustrato Km ↑= baja unión al sustrato, baja afinidad por el sustrato Km ↓= alta unión al sustrato, alta afinidad por el sustrato
Factores que afectan la velocidad de una reacción catalizada por enzimas Concentración de sustrato / cofactores Concentración de enzima Inhibidores Activadores p. H Temperatura Sales
Actividad específica La actividad específica es la velocidad de una reacción enzimática expresada en términos de la cantidad de enzima como proteína.
Diseño de un ensayo enzimático Para el diseño de un ensayo enzimático se requiere conocer la reacción que se analiza: A) Cuáles son las especies que se requieren: sustrato, la o las coenzimas, el o los cofactores, entre otros. B) La estequiometría de la reacción C) Los efectos de p. H, temperatura y fuerza iónica sobre la actividad de la enzima.
Actividad de Lactato deshidrogenasa
Tomar lectura cada 10 segundos por 120 segundos
U= µmol/min
Paso más eficiente de purificación. En este ejemplo: Cromatografía de Afinidad
¿Qué hacer en la práctica? 1. Cambiar el switch mental y enfocar los pensamientos en BIOQUÍMICA! 2. Realizar curvas temporales (determinar actividad por espectrofotometría) de todas las fracciones 3. ¡Mantener los tubos de extractos proteicos en hielo! Tomar alícuotas sin descongelar. 4. Determinar la actividad de la LDH mediante curvas temporales (registrar velocidades iniciales!!!)
Monitoreo de actividad enzimática Espectrofotometría HPLC
Monitoreo de actividad enzimática Radioensayos TLC
Preguntas para diagrama: 1)¿Qué contiene el medio de reacción para analizar la actividad de LDH? 2)¿Cuál es la concentración de NADH en la celda de reacción?
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