ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE Identificate negli anni 70 Enzimi

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE • Identificate negli anni ‘ 70 • Enzimi che tagliano il DNA in maniera sequenza-specifica • Sistema di riconoscimento di DNA estraneo dei batteri sistema “immunitario” batterico

Esempi di sequenze riconosciute da alcuni enzimi di restrizione

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE - STRUTTURA

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE - STRUTTURA

TAGLIO DEL DNA CON ENZIMI DI RESTRIZIONE • Riconoscimento della sequenza • Taglio asimmetrico estremità coesive • Taglio centrale estremità “blunt”

TAGLIO DI DNA GENOMICO CON ENZIMI DI RESTRIZIONE • Produzione di frammenti di dimensioni diverse • Frammenti estremamente numerosi

PERCHE’ TAGLIARE IL DNA CON ENZIMI DI RESTRIZIONE • Ogni gene può essere presente in uno o più frammenti di DNA • Mediante l’analisi dei frammenti specifici è possibile identificare alterazioni a carico di DNA cause di malattie genetiche

TIPI DI ALTERAZIONI CHE DANNO ALTERAZIONI DI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE • Assenza di un frammento o Delezioni di un pezzo di DNA • Alterazioni di dimensioni di un frammento o Duplicazioni di un pezzo di DNA • Comparsa o scomparsa di un nuovo frammento o Traslocazioni, mutazioni che causano la comparsa /scomparsa di un sito di restrizione

COME ANALIZZARE IL DNA TAGLIATO CON ENZIMI DI RESTRIZIONE • Separazione dei frammenti • Gel di agarosio • Trasferimento dei frammenti su un supporto più maneggevole • Southern blot • Ibridizzazione con sonde specifiche • Autoradiografia

Gel di agarosio • E’ un polimero lineare • La visualizzazione avviene grazie alla colorazione con etidio bromuro • Tale colorante contiene un gruppo planare che si intercala tra le basi del DNA dando origine ad un legame che aumenta la quantità di fluorescenza se confrontato con quello libero • La distanza della banda rispetto al punto di deposizione sul gel è inversamente proporzionale alla lunghezza del frammento amplificato

Gel Electrophoresis

SOUTHERN BLOT • Inventato all’inizio degli anni ‘ 80 da Ed Southern • Trasferimento del DNA separato elettroforeticamente su un supporto solido (nylon, nitrocellulosa) mediante capillarità

SOUTHERN BLOT

SOUTHERN BLOT Parametri importanti • Tampone deve passare attraverso il gel e non lateralmente (corto-circuito) • Forza ionica adeguata • Supporto e carta pre-trattati • Assenza di bolle d’aria • Legame del DNA al filtro mediante UV o “baking”

SOUTHERN BLOT

STRINGENZA

IBRIDIZZAZIONE Parametri importanti • Probe • Privo di sequenze ripetute • Privo di sequenze omologhe (pseudogeni) • Stringenza dell’ibridizzazione • Temperatura • Forza ionica nel buffer di ibridizzazione • Forza ionica nei buffer di lavaggio

SOUTHERN BLOT

ESPOSIZIONE Parametri importanti • Perfetta adesione del filtro alla lastra • Assenza di residui di tampone sul filtro • Durata dell’esposizione • Uso di Phosphorimager

SOUTHERN BLOT Analisi di delezione

SOUTHERN BLOT Analisi di espansione

Amplification Fragment Length Polymorphisms (Amp. FLPs) (1) Normal DNA (2) Mutant DNA PCR Product Restriction digestion analysis 1 2 3 SM