Ematologia di laboratorio Esame emocromocitometrico Anemie Malattie dei

Ematologia di laboratorio ü Esame emocromocitometrico ü Anemie ü Malattie dei leucociti ü Emostasi e trombosi

Sequenza crescita e maturazione cellule Sviluppo linfoide (linfoblasto, linfocita B, plasmacellula, linfocita T, cellule NK) Sviluppo mieloide (eritrociti, piastrine, leucociti neutrofili, eosinofili e basofili, monociti)

Specifiche Analitiche 25 Parametri: WBC, RBC, HGB, HCT, MCV, MCHC, PLT RDW-CV, RDW-SD, MPV, PDW, P-LCR NEUT %, LYMPH %, MONO%, EO%, BASO% NEUT#, LYMPH #, MONO#, EO#, BASO# HPC#, HPC% 5 Istogrammi: WBC, EO, BASO, RBC, PLT 2 Citogrammi WBC-DIFF, IMI

Principi e Tecnologie Sette Canali Analitici WBC (Linfo) DIFF ( Linfo, Mono, Gran. ) EOSINOFILI BASOFILI IMI ( Cellule Immature ) RBC / PLT HGB ( Emoglobina )

Principi e Tecnologie Principio Resistivo a Volume fisso

Principi e Tecnologie Canale WBC

Principi e Tecnologie Rilevazione RF/DC Segnale RF (Densita' e Volume Nucleare) Segnale DC (Volume Cellulare)

Principi e Tecnologie Canale DIFF

Principi e Tecnologie Conteggio RBC/PLT Rilevazione Resistiva con Focalizzazione Idrodinamica

Indici Eritrocitari MCH Emoglobina corpuscolare media Espresso in pg (26 -32) Hb / eritrociti < 26: IPOCROMIA > 32: IPERCROMIA MCHC Concentrazione emoglobinica corpuscolare media Hb (g/d. L) / ematocrito 32 -36%

Indici Eritrocitari RDW-SD Rappresenta l'ampiezza aritmetica della curva di distribuzione RBC. Viene calcolato come differenza volumetrica ad un'altezza pari al 20 %del picco RBC e viene espresso in femtolitri. RDW-CV Rappresenta l'ampiezza di distribuzione espressa in coefficiente di variazione(%). Viene calcolato dividendo la deviazione standard (SD) per il valore di MCV.

Indici piastrinici PDW (Ampiezza Distribuzione PLT ) E' calcolato come differenza volumetrica tra i 2 punti che tagliano la curva di distribuzione al 20% della sua altezza. MPV (Volume Piastrinico Medio ) E' calcolato dalla seguente formula: MPV(fl)=Pct(%) X 1000 / PLT (x 103 /ul) P-LCR (Percentuale Grandi Piastrine) Rappresenta la percentuale di piastrine aventi volume superiore a 12 fl. rispetto al numero totale di piastrine.

Principi e Tecnologie Determinazione HGB Metodica Sulfolyser Legame tra Globina e gruppo idrofobico SLS Modifica di Configurazione Ossidazione Fe 2+ Fe 3+ Legame con Gruppo Idrofilico SLS e formazione di Fe --> SLS-Hb

Citogramma RETICOLOCITI NRBC = globuli rossi nucleati, ovvero ERITROBLASTI

Principio di reazione canale IMI • • • Lipidi Colesterolo Fosfo-lipidi Glico-lipidi Super Surfactante • Amino Acidi WBC Maturi WBC Immaturi

Distribuzione Canale IMI PBSC = “peripheral blood staminal cells” Left shift = spostamento a sinistra della formula leucocitaria (immissione in circolo di leucociti immaturi)

Referto

Classificazione delle anemie Ridotta produzione di eritrociti • aplasia midollare • deficit B 12/folati • sindromi mielodisplastiche • infiltrazione midollare Aumentata distruzione • anemie emolitiche • cause extracorpuscolari (meccaniche, autoimmuni) Sintesi emoglobinica anomala o ridotta • sideropenia • disordini cronici • talassemie e Hb anomale

Parametri per lo studio del metabolismo del ferro FERRITINA TRANSFERRINA RECETTORE SOLUBILE DELLA TRANSFERRINA

Malattie dei leucociti Alterazioni della funzione Alterazioni quantitative non neoplastiche (mononucleosi, reazione leucemoide, neutropenia, …) Malattie neoplastiche • mieloproliferative (acute, croniche, sindromi mielodisplastiche) • linfoproliferative (acute, croniche, linfomi) • immunoproliferative (mieloma, amiloidosi, gammopatie monoclonali, …)

EMOSTASI MECCANISMO DI DIFESA A PROTEZIONE DELL’INTEGRITA’ DEL SISTEMA VASCOLARE LO STUDIO DELLA COAGULAZIONE, CHE PUO’ APPARIRE SEMPLICE, IN REALTA’ NASCONDE NON POCHE INSIDIE ANCHE NELL’ESECUZIONE DELLE METODICHE PIU’ COMUNI PER I NUMEROSI FATTORI CHE INFLUENZANO IL DATO FINALE DA UN PUNTO DI VISTA IDEALE, I RISULTATI ANALITICI DOVREBBERO RIFLETTERE I VALORI DEI PARAMETRI PRESENTI IN VIVO; E’ TUTTAVIA FACILE CAPIRE COME, DAL MOMEMTO IN CUI IL SANGUE FUORIESCE DAI VASI, VADA INCONTRO AD UNA SERIE DI CAMBIAMENTI A CARICO DEI SINGOLI COMPONENTI DELL’EMOSTASI, CHE POSSONO ALTERARE I RISULTATI IN MANIERA CONSIDEREVOLE

ALCUNI DI QUESTI CAMBIAMENTI AVVENGONO IMMEDIATAMENTE, COME L’ATTIVAZIONE DELLE PIASTRINE, LA LIBERAZIONE DEL FATTORE TESSUTALE E L’ATTIVAZIONE DELLA FASE DI CONTATTO; ALTRI SONO PIU’ TARDIVI E RIGUARDANO I FATTORI PIU’ LABILI SOGGETTI A PREMATURO DETERIORAMENTO GLI ERRORI CHE SI POSSONO VERIFICARE DURANTE LA FASE PREANALITICA SONO PARTICOLARMENTE CRITICI PERCHE’ SFUGGONO AI PROGRAMMI DI VALUTAZIONE ESTERNA ED INTERNA CHE PERMETTONO DI INDIVIDUARE VARIAZIONI NON VOLUTE CHE POSSONO VERIFICARSI DURANTE IL PROCEDIMENTO ANALITICO

VARIABILI PREANALITICHE LA VARIABILE PREANALITICA PUO’ RIGUARDARE: q LE CONDIZIONI DEL PAZIENTE AL MOMENTO DELPRELIEVO q LA RACCOLTA DEL SANGUE q LA PREPARAZIONE DEL PLASMA q LA CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE

Schema cascata coagulativa e test di screening Via intrinseca Chininogeno Precallicreina Fattore XII Fattore. XI Fattore. IX Fattore VIII APTT Fattore XIIIa Via estrinseca Tromboplastina Fattore VII Via comune Fattore X Fattore V Fattore II Fattore I Fibrina solubile Fibrina insolubile PT

Differenze fra sindromi emorragiche dovute alla fase vasculopiastrinica e alla fase coagulativa Difetto Vasopiastrinico Difetto Coagulativo Storia familiare Rara Frequente Preval. sessuale Femmine Maschi Tipo di sanguinamento Cute e mucose, petecchie ed ecchimosi, spontaneo Ematomi muscolari ed emartri, post-traumatici Modalita’ di presentazione Sanguinamento immediato dopo trauma, persistente Sanguinamento ritardato dopo trauma , ritardato e ricorrente Test di laboratorio PT e APTT normali TE e PLT alterati PT e/o APTT TE e PLT normali

Test di screening TEMPO DI EMORRAGIA CONTEGGIO DELLE PIASTRINE TEMPO DI PROTROMBINA TEMPO DI TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATO

TEMPO DI EMORRAGIA Definizione Il tempo di emorragia (o T. di Sanguinamento o T. di Stillicidio o Bleeding Time) e’ il tempo necessario all’arresto del sanguinamento da un piccolo taglio, di dimensioni standardizzate, provocato sulla superficie cutanea Intervallo di riferimento per il test secondo Ivy 2 – 9 minuti

TEMPO DI EMORRAGIA Finalita’ diagnostiche Il tempo di emorragia valuta l’interazione delle piastrine con la parete vascolare e la successiva formazione del tappo piastrinico. Un prolungamento del T. E. e’ riscontrabile, oltre che in casi di piastrinopenia o di piastrinopatia, anche in pazienti con carenza di alcuni fattori plasmatici (Fibrinogeno e Fv. W) e in soggetti con alterazioni della parete vascolare.

TEMPO DI EMORRAGIA Malattie congenite Alterazioni della componente vascolare Alterazioni della adesivita’ piastrinica al subendotelio Alcune forme di piastrinopatia Difetti nella formazione di fibrina nel tappo piastrinico

TEMPO DI EMORRAGIA Malattie acquisite Difetti di formazione di fibrina nel tappo piastrinico (DIC) Presenza in circolo di proteine anormali e anticorpi Anormalita’ di interazione fra endotelio e piastrine (m. renali, m. epatiche, anemie) Disordini funzionali acquisiti delle piastrine dovuti a farmaci (ASA, Antibiotici)

VIA INTRINSECA (a. PTT) VIA ESTRINSECA (PT) FXII FXI Ca 2+ FIX Eparina FVII Tissue Factor Ca 2+ AT VIII FX VIA COMUNE Ca 2+ FII FIBRINOGENO Fibrina FXIII FV Coagulo di Fibrina

TEMPO DI PROTROMBINA VII X Xa V II TROMBINA FIBRINOGENO FIBRINA

TEMPO DI PROTROMBINA Definizione Tempo di coagulazione del plasma in esame, reso povero in piastrine, dopo aggiunta di quantità ottimali di un estratto tissutale (tromboplastina) e di ioni calcio.

TEMPO DI PROTROMBINA Espressione dei risultati- ieri 1) TEMPO DI PROTROMBINA: ESPRESSIONE IN SECONDI 2) ATTIVITA’ PROTROMBINICA : ESPRESSIONE IN PERCENTUALE RISPETTO AD UN NORMALE 3) sec. paziente 4) 3) INDICE DI PROTROMBINA: ---------- x 100 5) sec normale 6) sec. paziente 4) RAPPORTO DI PROTROMBINA: ……………. . 5) sec normale

TEMPO DI PROTROMBINA Espressione dei risultati-oggi INR = International Normalized Ratio modello di espressione standardizzato proposto nel 1983 dall’OMS, definito come il rapporto PT paziente/PT normale elevato all’ ISI (International Sensitivity Index ); l’ISI indica la sensibilità della tromboplastina utilizzata rispetto alla Tromboplastina di Riferimento Internazionale (per definizione ISI = 1). L’espressione dei risultati in INR dovrebbe superare il problema della variabilita’ dei sistemi di misura e consentire la comparabilita’ dei risultati ottenuti nei vari laboratori.

TEMPO DI PROTROMBINA Via coagulativa esplorata Il PT misura l’attività della via estrinseca (F VII) e della via comune (F II, V, X); fattori sintetizzati dal fegato e vitamina K dipendenti (F II, VII, X). Misura inoltre il livello di fibrinogeno (F I). Popolazione normale: 0. 85 – 1. 25 INR Pazienti TAO: 2. 00 – 4. 5 INR

TEMPO DI TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATA ( APTT ) Definizione Tempo in secondi richiesto per la formazione del coagulo di fibrina in un campione di plasma citratato, povero di piastrine, per azione di un attivatore della fase di contatto ed in presenza di fosfolipidi, che simulano quelli piastrinici, e di ioni calcio.

TEMPO DI TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATA ( APTT ) Procedimento analitico Il plasma citratato, un attivatore di contatto (farina fossile) e dei fosfolipidi procoagulanti (cefalina) vengono mescolati e incubati a 37° C. L’attivatore di contatto attiva i Fattori XI e XII. I Fosfolipidi forniscono la superficie per l’interazione dei fattori della coagulazione. Dopo l’incubazione viene aggiunta una quantita’ appropriata di ioni calcio, che promuovono l’attivazione della via intrinseca della cascata coagulativa, e misurato il tempo di formazione del coagulo.

TEMPO DI TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATA ( APTT ) Espressione dei risultati I valori sono espressi in SECONDI RATIO (Rapporto fra il valore in secondi dell’APTT del plasma campione e il valore in secondi dell’APTT del plasma di riferimento ) L’espressione in RATIO dovrebbe migliorare la comparabilità dei risultati tra i vari laboratori e dello stesso laboratorio in giorni differenti.

TEMPO DI TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATA ( APTT ) Via coagulativa esplorata Il test APTT esplora la via intrinseca (fattori VIII, IX, XII) e la via comune (fattori I, II, V, X) della coagulazione. intervalli di riferimento Popolazione normale: 26 – 42 secondi 0. 60 – 1. 23 Ratio

Possibili anomalie dell’emostasi esplorata con i test di primo filtro TE PT APT T Fase alterata Fase emostasi anormale N N N A N N Vasopiastrinica Piastrinopenie Piastrinopatie N N A Coagulativa FVIII, FIX, FXIII N A N Coagulativa FVII N A A Coagulativa FX, FV, FII, FI A N N m v. Willebrand A A A Vasopiastrinica Coagulativa Difetti Globali emostasi

TEST COMPLEMENTARI DOSAGGIO FIBRINOGENO DOSAGGIO ANTITROMBINA D-DIMERO TEMPO DI TROMBINA

FIBRINOGENO Definizione Il fibrinogeno è una glicoproteina sintetizzata dal fegato, costituita da tre coppie di catene polipeptidiche (Aa, Bß, γ) legate da ponti disolfurici S-S, che dopo clivaggio proteolitico da parte dell’enzima procoagulante trombina e l’intervento del F XIIIa è convertita in fibrina insolubile stabilizzata. Ha una emivita di circa 3 -5 giorni.

FIBRINOGENO METODI DI DOSAGGIO 1)METODO IMMUNOLOGICO 2)METODI COAGULATIVI METODO DI CLAUSS METODO PT DERIVATO

FIBRINOGENO Metodo di Clauss Il metodo piu’ usato per il dosaggio del fibrinogeno è il metodo funzionale secondo Clauss. Usando un eccesso di trombina il tempo di formazione del coagulo del plasma diluito è inversamente proporzionale alla concentrazione del fibrinogeno plasmatico.

FIBRINOGENO Metodo PT Derivato Metodo fotometrico che consente di valutare la concentrazione del fibrinogeno plasmatico dalla variazione di assorbanza durante il dosaggio del tempo di protrombina. Il vantaggio è il contemporaneo dosaggio del Fibrinogeno e del PT. Buona correlazione con il metodo di Clauss per livelli di fibrinogeno normali, scarsa comparabilità dei risultati per PT prolungato (es. in TAO), per valori elevati o bassi di fibrinogeno, in corso di terapia trombolitica.

FIBRINOGENO Metodo Immunologico Impiego basilare nella diagnostica delle disfibrinogenemie dove, in presenza di una ridotta fibrinogenemia determinata con metodi funzionali, si osserva una normale concentrazione della proteina valutata come antigene.

FIBRINOGENO Espressione dei risultati e intervallo di riferimento I risultati vengono espressi in mg/dl Intervallo di riferimento 200 -400

D-DIMERO Definizione Il d-dimero è il piu’ piccolo frammento del peso di 182 kd resistente alla plasmina, descritto per la prima volta da Gaffney nel 1972. Puo’ essere considerato un indice globale di attivazione emostatica, in quanto è il prodotto finale di una sequenza di reazioni che portano alla degradazione della fibrina stabilizzata ad opera della plasmina. Ha una emivita di 4 -6 ore.

Attivita fibrinolitica della plasmina PLASMINA Fibrinogeno Fibrina stabilizzata Fibrina I Bß 1 -42 Bß 15 -42 Frammento D Dimero-D Frammento E

D-Dimero Metodi di determinazione Dosaggio semiquantitativo mediante utilizzo di particelle di lattice, rivestite di anticorpi monoclonali specifici per i DDimeri Dosaggio immunoenzimatico Dosaggio immunoturbidimetrico

D-DIMERO Procedimento analitico Il dosaggio del D-Dimero viene eseguito con un metodo quantitativo immunologico al lattice. Il reattivo è composto da una sospensione di microparticelle del diametro molto piccolo (da 0. 1 a 0. 2 μ) unite con legame covalente a due anticorpi murini monoclonali anti DD scelti per la loro reattività nei confronti dei diversi prodotti di degradazione della fibrina. La dimensione di queste particelle rende il mezzo di reazione praticamente trasparente e la luce è assorbita in misura molto modesta. In presenza di D-D la reazione antigene-anticorpo provoca un’agglutinazione delle microparticelle che rendono il mezzo opaco. Questo aumento di torbidità è misurato a 540 nm ed è proporzionale alla quantita’ di D-D presenta nel campione.

D-DIMERO Significato del test Importante il suo significato prognostico negativo. La sua negatività favorisce l’esclusione di diagnosi di trombosi venosa profonda ed embolia polmonare. Bassa specificità e basso valore predittivo positivo del D-Dimero nella diagnosi dell’evento tromboembolico. Infatti, aumenta in altre situazioni patologiche quali: Coagulazione intravascolare disseminata, Neoplasie, Patologia epatica, Sindrome Nefrosica, Insufficienza renale, Periodo postoperatorio, Gravidanza, Sforzo fisico eccessivo.

D-DIMERO Espressione dei risultati I risultati vengono espressi con il metodo in uso, in g/ml di FEU ( Unita’ Fibrinogeno Equivalenti). FEU = quantità nota di D-Dimero rispetto una quantità nota di fibrinogeno sottoposta all’azione della trombina e della plasmina (standard D-D in FEU). Intervallo di riferimento fino a 0. 80 g/ml FEU. I risultati possono anche essere espressi in g/ml di D-D. Il valore FEU è il doppio di quello espresso in g/ml di DD.

PT PROLUNGATO APTT PROLUNGATO Ricerca eparina Anamnesi Positiva Negativa Paziente in TAO Positiva miscela Nessuna correzione Correzione Ricerca LAC Dosaggio di fattori Inibitori specifici

DOSAGGIO DEI FATTORI DELLA COAGULAZIONE Metodo qualitativo: misura l’attivita’ di una molecola Metodo quantitativo: misura l’intera entita’ molecolare intesa come capacita’di comportarsi da antigene e reagire con anticorpi specifici

DOSAGGIO FUNZIONALE DEI FATTORI o. Si basa sulla modificazione dell’APTT e del PT o. Il plasma in esame viene diluito o miscelato con un plasma contenente in eccesso tutti i fattori della coagulazione tranne il fattore in esame o. L’APTT o il PT, eseguito su questa miscela, fornira’ un tempo di coagulazione dipendente esclusivamente dall’attivita’ del fattore in esame contenuto nel campione

TROMBOFILIA Gli anticoagulanti naturali modulano i processi emocoagulativi impedendo che essi procedano in modo eccessivo. La formazione del trombo e’ il risultato di un’insufficiente azione di questi inibitori fisiologici. La carenza congenita degli anticoagulanti naturali e’ trasmessa generalmente come carattere autosomico dominante ed e’ correlata ad alto rischio di manifestazioni trombotiche anche in giovane eta’. Il rischio e’ ulteriormente aggravato dalla carenza contemporanea di piu’ anticoagulanti naturali. Gli eventi trombotici possono essere favoriti da eventi esterni quali: traumi, interventi chirurgici , obesita’, contraccezione orale…

TROMBOFILIA Il trombo rappresenta la lesione patognomonica della trombofilia. Si forma all’interno dei vasi per effetto di un abnorme attivazione del sistema emostatico. Tale condizione puo’ restare a lungo senza conseguenze cliniche, ma puo’ anche determinare l’occlusione vascolare in concomitanza di un’insufficienza relativa o assoluta dei meccanismi naturali di controllo.

Meccanismi di controllo reazioni emocoagulative XII XI P. K. HMWK TF IX PS-PCa TF VIII X V II VII TFPI At. III TROMBINA

Test di laboratorio nella trombofilia I test di laboratorio che permettono di diagnosticare predisposizione o stato di tromboembolia sono: ANTITROMBINA PROTEINA C PROTEINA S APCR (Resistenza alla proteina c attivata) LUPUS ANTICOAGULANT (LAC)

Test di laboratorio nella trombofilia Test di laboratorio che permettono di diagnosticare predisposizione o stato di tromboembolia sono: MUTAZIONE G 20210 A DELLA PROTROMBINA ANTICORPI ANTIFOSFOLIPIDI ANTICORPI ANTICARDIOLIPINA OMOCISTEINA DISFIBRINOGENEMIA DIFETTI DI PLASMINOGENO DIFETTI DI t. PA DIFETTI DI HC II AUMENTO DEL PAI -1

ANTITROMBINA Definizione E’ UNA GLICOPROTEINA PLASMATICA A CATENA SINGOLA DEL P. M. DI 58 Kd. VIENE SINTETIZZATA NEGLI EPATOCITI E NELLE CELLULE ENDOTELIALI ED ESCRETA DAI RENI. LA SUA EMIVITA E’ DI 60 ORE. APPARTIENE ALLA FAMIGLIA DELLE SERPINE (SERIN PROTEINASI INHIBITOR) E INIBISCE LE PROTEASI SERINICHE INTERVENGONO NEL PROCESSO COAGULATIVO.

ANTITROMBINA Funzioni (I) L’Antitrombina è uno dei principali inibitori fisiologici della coagulazione: la sua azione si estrinseca attraverso l’inattivazione di tutte le proteasi seriniche ad azione procoagulante (IIa, XIa, IXa, Pka) con le quali forma un complesso stabile, equimolare, privo di attivita’ residua.

ANTITROMBINA Funzioni (II) L’azione inibitoria dell’Antitrombina e’ di per se’ lenta, ma e’ notevolmente accelerata in vitro dall’eparina (cofattore eparinico I). In vivo l’azione dell’AT e’ probabilmente mediata ed accelerata dal suo legame con i glicosaminoglicani eparino-simili che si trovano sulla parete vascolare

ANTITROMBINA Diagnosi di laboratorio Metodi Funzionali Metodi coagulativi Metodi cromogenici Metodi Immunologici Immunodiffusione radiale Elettroimmunodiffusione ELISA

ANTITROMBINA Procedimento analitico METODO FUNZIONALE CROMOGENICO: Plasma diluito + eparina + trombina in eccesso Complessi Trombina-Antitrombina + TROMBINA RESIDUA Viene misurata utilizzando un substrato cromogenico

ANTITROMBINA Espressione dei risultati e intervallo di riferimento La densità ottica misurata viene letta sulla curva di calibrazione con ottenimento della % di attività. I risultati vengono espressi in % Intervallo di riferimento: 80% -120%

ANTITROMBINA Difetti congeniti Le carenze congenite portano a fenomeni di tromboembolia piu’ frequentemente venosa che non arteriosa. Le carenze di AT vengono classificate come: TIPO I: Livelli antigenici e funzionali ridotti TIPOII: Presenza di livelli plasmatici normali ma riduzione della capacita’ di nautralizzare la trombina o di legare l’eparina

ANTITROMBINA Difetti acquisiti I difetti acquisiti si possono osservare nel corso di svariate condizioni patologiche tra cui: -Epatopatie (cirrosi, neoplasie) -CID e Ustioni (per rapido consumo di Antitrombina) -Sindromi nefrosiche (perdita proteica per compromissione del filtro renale) -Gastroenterite acuta (Entropatia proteino disperdente) -Chemioterapia (Maggior attivazione della trombina e conseguente consumo di antitrombina) -Neoplasie e Leucemie (Immissione di materiale procoagulante e conseguente consumo di antitrombina)

ANTITROMBINA Condizioni fisiologiche particolari Si osserva : -riduzione fisiologica nei neonati per ridotta sintesi epatica di AT fino al 6° mese; -riduzione nei maschi adulti dopo i 30 anni, che diventa piu’ marcata dopo i 60 anni; -riduzione nelle femmine in eta’ fertile con un andamento che segue quello ormonale (massimi durante il mestruo, minimi durante l’ovulazione); -riduzione durante la gravidanza.

ANTITROMBINA Condizioni terapeutiche particolari Riduzione nella chirurgia maggiore con picco riduttivo in terza giornata post-operatoria e ritorno alla normalita’ intorno alla quinta; Riduzione nella terapia estroprogestinica (aumenta di 5 volte il rischio tromboembolico); L’eparina induce un aumentato catabolismo della At (la somministrazione e. v. o s. c. a dosi terapeutiche puo’ causare una riduzione dal 5% al 31% dei livelli di At in circolo); La TAO aumenta i livelli di At come conseguenza della ridotta sintesi dei fattori del complesso protrombinico.

ANTITROMBINA Utilizzo clinico L’Antitrombina ha i seguenti utlizzi clinici: -Dosaggio pre-operatorio -Dosaggio basale ante terapia eparinica -Dosaggio in Trombosi venosa profonda giovanile ed embolia polmonare per valutare alterazioni congenite o riduzioni acquisite -Controllo in terapia estroprogestinica

PROTEINA C COAGULATIVA La Proteina C coagulativa (PC) e’ un inibitore fisiologico del fattore Va e VIIIa. Ha una azione inibitrice della trombina attraverso un complesso meccanismo regolatore. La PC attivata (APC) modula inoltre l’attivazione del plasminogeno e del t. PA favorendo la fibrinolisi. La PC e’ sintetizzata nel fegato ed escreta dai reni. L’emivita e’ di 7 ore.

Attivazione e azione della PC Ca 2+ V BLOOD FLOW APC PS VIIIa IXa VIIIa inactive PC APC V a inactive PC Ca 2+ THROMBOMODULIN T Va Xa V PS PHOSPHOLIPID SURFACE APC Ca 2+

PROTEINA C Difetti congeniti I difetti genetici da carenza totale sono incompatibili con la vita Le carenze congenite parziali possono portare a fenomeni di tromboembolia piu’ frequentamente venosa che arteriosa La PC e’ vitamina K-dipendente ed ha una emivita breve per cui si manifesta un deficit di PC in anticipo rispetto all’inattivazione degli altri fattori da parte della TAO Le carenze vengono clessificate come: TIPO I : livelli antigenici e funzionali ridotti TIPOII : Presenza di livelli plasmatici normali ma riduzione della funzionalita’

PROTEINA C Difetti acquisiti Ridotta sintesi Aumentata escrezione Aumentato consumo Cirrosi epatica Sindrome nefrosica CID Epatopatia cronica Plasmaferesi Porpora trombotica trombocitopenica Insufficienza epatica fulminante Intervento chirurgia maggiore Pazienti con metastasi epatiche Ictus acuto ischemico Pazienti con leucemia acuta

PROTEINA C Condizioni fisiologiche Si osserva riduzione fisiologica nei neonati per ridotta sintesi epatica di PC fino al 6° mese. La gravidanza dal 1° trimestre induce aumento dei livelli di PC che si mantengono alti fino al momento del parto e del puerperio. Correlazione positiva fra l’eta’ e la concentrazione plasmatica di PC.

PROTEINA C Condizioni terapeutiche particolari L’uso della terapia estro-progestinica induce aumento dei livelli di PC (aumento della sintesi epatica dei fattori vit. K dipendenti) Assunzione di anticoagulanti orali causa la riduzione di PC (proteina vit. K dipendente) Il trattamento con L-asparaginasi nelle leucemie acute e nei linfomi causa una riduzione di PC (tossicita’ del farmaco a livello epatico) La somministrazione orale di uno steroide anabolizzante, lo Stanazololo, provoca un aumento della PC (gli epatociti conterrebbero recettori per gli steroidi capaci di legare gli steroidi anabolizzanti)

PROTEINA C Test di laboratorio I test di laboratorio di tipo funzionale sono in grado di individuare sia i difetti di Tipo II. I test si basano sull’attivazione dalla PC presente nel campione in esame mediante veleno di serpente (Protac). L’azione della proteina C endogena cosi’ attivata, si valuta quindi verificando il prolungamento da essa determinato di un Aptt (metodo coagulometrico) o la capacita’ della stessa di agire su un substrato cromogenico specifico (metodo cromogenico).

PROTEINA S COAGULATIVA La proteina S (PS) e’ un cofattore della PCa nella inattivazione dei fattori Va e VIIIa, e’ vitamina K dipendente. Il 35% della PS circola in forma libera. Questa porzione e’ quella che agisce come cofattore della PC. Il restante 65% e’ legata in modo reversibile alla proteina C 4 b-BP (binding protein) appartenente al sistema del complemento. Questo legame con la PS non modifica l’attivita’ regolatrice della C 4 b. BP nel sistema del complemento. La PS e’ sintetizzata dal fegato, dalle piastrine e dalle cellule endoteliali ed e’ escreta dai reni.

C 4 b. BP PS IX TF -VIIa PS PS IXa VIIIa X PS Xa Va Protrombina • Agisce come cofattore dell’ a. PC nell’inattivazione di FVa e FVIIIa, eliminando la protezione di FIXa su FVIII e di FXa su FV. • Da sola inibisce il complesso protrombinasi ed il complesso attivante il FX con interazione diretta con FVa, FXa, FVIII.

PROTEINA S Difetti congeniti LE CARENZE DI PS VENGONO CLASSIFICATE COME: TIPO I : livelli antigenici ridotti della PS totale e libera conseguente riduzione della funzionalita’. TIPO II : livelli antigenici normali sia della PS totale e libera, ma riduzione della funzionalita’. TIPO III: livelli antigenici normali della PS totale ma riduzione del livello della PS libera e riduzione della funzionalita’.

PROTEINA S Difetti Acquisiti Trattamento con anticoagulanti orali Gravidanza Epatopatie Coagulazione intravascolare disseminata Diabete Contraccettivi Trattamento con l-asparaginasi Infiammazione

Proteina S Significato Clinico n. E’ carente nel 3 -5% di pazienti con trombosi ricorrente. n. Il 50% dei pazienti con deficienza congenita ha il primo evento trombotico prima dei 25 anni. n. Trombosi venosa profonda e prossimale, embolia polmonare possono intervenire livelli di Proteina S < 50%.

MODIFICAZIONE ACQUISITE DI AT, PC, PS Evento acuto AT, PC, PS Terapia eparinica AT TAO PC, PS Epatopatie AT, PC, PS Gravidanza PS, PC T. estroprogestinica PS, PC

SINDROME DA ANTICORPI ANTIFOSFOLIPIDI La sindrome da anticorpi antifosfolipidi (APS) e’ un disordine acquisito di origine ignota, caratterizzato da trombosi arteriose e/o venose e complicanze della gravidanza che si associano alla presenza nel sangue degli anticorpi antifosfolipidi ( a. PL). Gli a. PL allungano i tempi di coagulazione dei tests fosfolipidedipendenti della coagulazione (LAC), oppure sono evidenziati mediante tecniche ELISA che utilizzano la cardiolipina o altri fosfolipidi a carica netta negativa come antigeni in fase solida.

ANTICOAGULANTE TIPO LUPUS Diagnosi di laboratorio 1)Allungamento di uno o piu’test fosfolipide-dipendenti (TEST DI SCREENING) 2)Dimostrazione che l’allungamento sia effettivamente dovuto alla presenza di un anticoagulante circolante (TEST DI MISCELA) 3)Dimostrazione che l’anticoagulante sia diretto contro i fosfolipidi (TEST DI CONFERMA)

ANTICOAGULANTE TIPO LUPUS Diagnosi di laboratorio TEST DI SCREENING: APTT (Tempo di tromboplastina parziale attivato) KCT (Tempo di coagulazione al caolino) d. RVVT (Test al veleno di Vipera Russell diluito)

ANTICOAGULANTE TIPO LUPUS Diagnosi di laboratorio TEST DELLA MISCELA: Si esegue con uno dei test di screening e consiste nella ripetizione del test su una miscela plasma paziente /plasma normale. La persistenza del prolungamento del tempo di coagulazione eseguito sulla miscela (mancata correzione) suggerisce la presenza di un anticoagulante circolante.

ANTICOAGULANTE TIPO LUPUS Diagnosi di laboratorio TEST DI CONFERMA: Sono basati sull’incremento o la diminuizione della concentrazione dei fosfolipidi o sull’uso di fosfolipidi a conformazione particolare. Il tempo di coagulazione di un test dipendente dai fosfolipidi, prolungato per la presenza di LA, si accorcia sensibilmente fino a correggere quasi completamente il difetto, se ripetuto aumentando la concentrazione dei fosfolipidi. Alternativamente il test si prolunghera’ se viene diminuita la concentrazione dei fosfolipidi.

APC RESISTANCE Responsabile di circa il 20% dei casi di trombosi venose consecutive e di circa il 50% dei casi selezionati come trombosi eredofamiliari. MAGGIOR FATTORE DI RISCHIO GENETICO PER TROMBOSI VENOSA FINORA SCOPERTO

APC RESISTANCE E’ una malattia ereditaria congenita scoperta da DAHLBACK nel 1993 I pazienti insensibili all’APC mostrano una diminuzione dello allungamento dell’APTT in presenza di Proteina C attivata Un anno piu’ tardi Bertina (Leiden Olanda) scopriva una anormalita’ nel Fattore V

ATTIVAZIONE DEL FATTORE V IIa/Xa NH 2 A 1 A 2 IIa/Xa Iia/Xa B A 3 C 1 C 2 COOH Fragments Factor. Va Ca 2+ Heavy chain 94 k. Da Zoller. B. , Familial Thrombophilia, 1996 74 k. Da Light chain

INATTIVAZIONE FATTORE V NH 2 A 1 A 2 Heavy chain B A 3 Thrombin A 1 A 2 Ca 2+ Light chain A 3 FV: R 506 C 1 C 2 COOH FV FVa C 1 C 2 APC Ca 2+ 306 APC 506 679 Ca 2+ Zoller B. , Familial Thrombohilia, 1996 FVi

INATTIVAZIONE FATTORE V NH 2 A 1 A 2 Heavy chain B A 3 Thrombin A 1 COOH A 2 A 3 FV: R 506 Ca 2+ APC 506 679 Ca 2+ Zoller B. , Familial Thrombohilia, 1996 FV FVa Ca 2+ Light chain 306 C 1 C 2 APC FV: Q 506 306 Ca 2+ APC 679 FVi

FATTORE V: Q 506 ( LEIDEN) Mutazione puntiforme nel nucleotide 1691, esone 10 del gene codificante il FV CGA Arginina CAA Glutammina Su un sito che corrisponde ad un sito di clivaggio della APC e’ meno efficiente ad inattivare il FVa Bertina R M. e altri , Nature , 1994

MALATTIE TROMBOTICHE EREDITARIE CARENZA INCIDENZA AT 1 – 5% PC 6 – 9% PS 3 – 13% MUTAZIONE F II APCR Lane DA. e altri, Thrombosis Haemostasis, 1996 5% > 20%

APC RESISTANCE PREVALENZADEL FATTORE V LEIDEN NELLA POPOLAZIONE GLOBALE EUROPEA Austria 2% Italy 0 -2% Finlandia 3% Netherlands 3 -5% France 1 -10% Poland 1% Germany 4 -8% Sweden 5 -10% Greece 15% Spain 3% Iceland 5% UK 3 -8% Rees DC e altri , Lancet , 1995; Rees DC e altri, Br. J. Haematol. , 1996

APC RESISTANCE PREVALENZA IN PAZIENTI TROMBOTICI ED IN INDIVIDUI SANI Pazienti con trombosi% Koster et al. 1993 21 Griffin et al. 1993 52 -64 Svensson et al. 1994 40 Cadroy et al. 1994 19 Tosetto et al. 1994 10 Simioni et al. 1997 16. 3 Individui sani % 5 7 1. 5 1

APC RESISTANCE DIAGNOSI DI LABORATORIO PRINCIPIO DEL TEST: 2 APTT su plasma indiluito del paziente --in presenza di una quantita’ standardizzata di APC --in assenza di APC IL RISULTATO SI ESPRIME IN APC ratio: t (sec) APTT + APC t (sec) APTT - APC Dalback e altri, Proc Nat Acad Sci, 1993

APC RESISTANCE INTERFERENZE ALLUNGAMENTO DELL’APTT per: • Difetto di fattori • Presenza di LAC • Terapia eparinica • TAO AUMENTO DEL FATTORE VIII per: • Gravidanza • Fase acuta • Assunzione di estroprogestinici de Ronde e Bertina, 1994; Hampton e altri, 1994; Bokarewa e altri, 1994; Ehrenforth e altri, 1995; Martorell e altri, 1995