ELVLASZTSTECHNIKA VI ELEKTROFORZIS Dr Kremmer Tibor ETVS LORND
ELVÁLASZTÁSTECHNIKA VI. ELEKTROFORÉZIS Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest
ELEKTROFORÉZIS ELEKTROMIGRÁCIÓ SZABAD HATÁRFELÜLETŰ (ZÓNA) ELEKTROFORÉZIS GÉLELEKTROFORÉZIS DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS
Arne TISELIUS professzor
TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS Tiselius (1925 – 1930) Szabad határfelületű (zóna) elektroforézis, 1948 Nobel-díj Elektroforézis hordozók bevezetése (1930 – 1950) - porok (cellulóz) - szűrőpapír - gélek (hidrolizált keményítő, agar-agar, agaróz, agaropektin) - membránok (cellulóz acetát) Poliakrilamid gélek (1950 – 1960) - pórusméret, molekulaszűrés, gradiens technikák - készülék fejlesztések (slab – disc, horizontális – vertikális) Detergens gélelektroforézis, SDS-PAGE (1960 – 1970) - Izoelektromos fokuszálás Kapilláris elektroforézis és kapcsolt technikák 1990 – től - CZE, CGE, MEKC, CIEF, CITP, ACE, CEC
AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI ELVÁLASZTÁS ELEKTROMOS ERŐTÉRBEN TÖLTÉSSEL RENDELKEZŐ MOLEKULÁK ELTÉRŐ ELEKTROFORETIKUS MOBILITÁSA ALAPJÁN AZ ELVÁLASZTÁS TÉNYEZŐI AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG TULAJDONSÁGAI AZ ELVÁLASZTÁS KÖZEGE (HORDOZÓ) AZ ELEKTROMOS ERŐTÉR
AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG TULAJDONSÁGAI ELEKTROMOS TÖLTÉSSEL RENDELKEZZEN (POZITÍV, VAGY NEGATÍV, IZOELEKTROMOS PONT, p. I), IONIZÁLHATÓ (INDUKÁLHATÓ), VAGY IONOS ÁLLAPOTBA HOZHATÓ (detergens micella) LEGYEN, KÉMIAI SZERKEZETE (stabilitás), FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI (disszociáció, erős – gyenge) KÖLCSÖNHATÁSAI (aggregáció, asszociáció) MÉRETE – TÖMEGE (kis molekulák – biopolimerek – fehérjék) ALAKJA (globuláris – fibrilláris) BELSŐ VISZKOZITÁS (konformáció) OLDÉKONYSÁG, DETEKTÁLHATÓSÁG, BIOLÓGIAI AKTIVITÁS
IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK A FEHÉRJÉK MOLEKULA SZERKEZETÉBEN
A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE A molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggése (eltérése) a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: M – molekulatömeg, a – Stokes-féle rádiusz, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, N – Avogadro-féle szám, D – diffuziós állandó, η – viszkozitási együttható.
AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI AZ ELVÁLASZTÁS KÖZEGE (HORDOZÓ) HALMAZÁLLAPOTA Folyadék (szabad határfelületű, vagy zónális), Szilárd (cellulóz – papír, szemcsék, membránok) Félfolyékony rendszerek (gélek, hidrofil polimerek) MINŐSÉGE Polaritás, dielektromos állandó, oldószer erősség, Viszkozitás, Hőmérséklet (hűtés !), ELEKTROKÉMIAI TULAJDONSÁGOK Ionerősség – ion minőség, p. H (puffer)
AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)
TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE
N, N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK
AZ ELEKTROFORÉZIS TECHNIKÁKBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLT PUFFER RENDSZEREK Puffer p. H tartomány Citrát (-dihidrogén, -hidrogén) 2 - 6, 0 2, 6 - 6, 5 Dietil barbiturát (Veronál-Na) 7, 0 - 10 Kálium hidrogén ftalát 2, 2 - 6, 5 Nátrium formiát 3, 0 - 4, 4 Nátrium acetát 4, 2 - 5, 4 Trietanolamin 6, 7 - 8, 7 Nátrium borát 8, 0 - 9, 8 Ammónium acetát 8, 6 -9, 8 Nátrium dihidrogén foszfát 2, 0 -6, 0 és 8, 0 -12, 0 Kálium dihidrogén foszfát 2, 0 -8, 0 és 9, 0 -13, 0 Bis-tris-propán 4. 0 – 8. 0
ELEKTROFORÉZIS AZ ELEKTROFORÉZIS KÖZEGÉNEK JELLEMZŐI IONERŐSSÉG (I) - IONMINŐSÉG összefüggésből számítható, ahol: ci az i-edik ion koncentrációja, 2 zi az i-edik ion töltés számának négyzete.
AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI AZ ELEKTROMOS ERŐTÉR JELLEGE – HOMOGENITÁSA Lineáris – radiális, síkban – térben, INTENZITÁSA E = V. d-1 (Volt /m) AZ ELEKTROMOS ÁRAMKÖR Ohm – törvény Joule - hő V = R. I Q = f (I)
AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI VÁNDORLÁSI SEBESSÉG ( ) ELEKTROFORETIKUS MOBILITÁS ( ) (Volt-1 sec-1 m 2) t idő (sec) m = a molekula összetett paramétere, ~10 -8 (előjel – irány) „net charge” - eredő (össz) töltés, ionizáltsága (erössége-foka) anyagi minősége, hidrodinamikai ellenállása, közeg viszkozitása, ionerőssége-ion minősége, p. H-ja, speciális vezetőképessége STOKES-féle törvény frikciós együttható (f) i = qi / 6 r f = 6 r
Tiselius (1948) Nobel-díj SZABAD HATÁRFELÜLETŰ „ZÓNA” ELEKTROFORÉZIS HORIZONTÁLIS papír keményítő H membrán (cellulóz acetát) GÉL (agaróz, dextrán, poliakril amid) ELEKTROFORÉZIS
HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA „KLASSZIKUS” PAPÍRELEKTROFORÉZISSEL LDL HDL ( + )
HUMÁN SZÉRUM CHYLOMICRON VLDL LIPO PROTEIN OSZTÁLYOK (SEM)
HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA ELFO VLDL HDL UC
HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZISSEL AGARÓZ GÉLEN FESTÉS Sudan Black B
HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL
HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ÉS LIPIDEK ÖSSZEHASONLÍTÓ DIAGNOSZTIKAI VIZSGÁLATA
ELŐFESTETT EGÉR SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA VERTIKÁLIS (DISC) POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL VLDL HDL
FEHÉRJÉK MOLEKULATÖMEG MEGHATÁROZÁSA VERTIKÁLIS (SLAB) PÓRUS-GRADIENS SDS-POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL LMW MOLEKULATÖMEG STANDARD FEHÉRJÉK
EHRLICH ASCITES TUMORSEJT MEMBRÁN FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA VERTIKÁLIS (DISC) SDS-POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL
HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS GLIKOPROTEINEK DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS (SDS-PAGE) VIZSGÁLATA FESTÉS COOMASSIE BRILLANT BLUE AGP PERJODÁT-SCHIFF (PAS)
HUMÁN SZÉRUM AGP GENETIKAI VARIÁNSAINAK ELVÁLASZTÁSA IZOELEKTROMOS FOKUSZÁLÁSSAL (IEF GÉLELEKTROFORÉZIS) F 1 SA O - 8990 O - 9130 L - 1328 NP - XXII p. I 4, 93 5, 06
HUMÁN SZÉRUM LAKTÁT DEHIDROGENÁZ IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSA HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL
AZ LDH IZOENZIMEK TETRAMER SZERKEZETE ALEGYSÉGEK H ~ MÁJ (HEPAR) M ~ IZOM (MUSCLE)
AZ LDH in situ KIMUTATÁSÁNAK SZINREAKCIÓJA LDH PIROSZŐLŐSAV + NADH FENAZIN METOSZULFÁT NADH + TETRAZÓLIUMKÉK NAP + FORMAZÁN
KÓROS HUMÁN SZÉRUM LDH-IZOENZIM FELVÉTELEK
KÜLÖNBÖZŐ KÓROS HUMÁN SZÉRUM LDH-IZOENZIM FELVÉTELEK DENZITOMETRIÁS KIÉRTÉKELÉSE
- Slides: 40