ELVLASZTSTECHNIKA I MINTAELKSZTS ELMLETE MVELETEI S ALKALMAZSAI Dr

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA I. MINTAELŐKÉSZÍTÉS ELMÉLETE, MŰVELETEI ÉS ALKALMAZÁSAI Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

KÉMIAI TUDOMÁNYOK SZERVETLEN – SZERVES KLASSZIKUS SZERVETLEN ÉS SZERVES ANALITIKAI KÉMIA BIOLÓGIA – BIOMOLEKULÁRIS KÉMIA BIOANALITIKA ELVÁLASZTÁSTECHNIKÁK ELVÁLASZTÁSTUDOMÁNY

Paradigma váltás a BIOANALITIKÁBAN PROTEOME (Wasinger et al. 1995) „protein equivalent of a genom” „protein complement encoded by a given genom” PROTEOMICS - GENOMICS

PROTEOMICS (Wang és Hanasch, 2003) EXPRESSION PROTEOMICS A genomban kódolt valamennyi fehérje azonosítása és mérése, Celluláris lokalizációjuk és poszt-transzlációs módosításuk meghatározása. FUNCTIONAL PROTEOMICS A FEHÉRJÉK KÖLCSÖNHATÁSAINAK VIZSGÁLATA AZ INDIVIDUÁLIS FEHÉRJÉK SZEREPÉNEK MEGHATÁROZÁSA A SPECIFIKUS ANYAGCSERE FOLYAMATOKBAN ÉS CELLULÁRIS STRUKTÚRÁKBAN A FEHÉRJÉK SZERKEZETÉNEK ÉS FUNKCIÓJÁNAK FELDERÍTÉSE

FUNKCIONÁLIS PROTEOMIKA BIOMOLEKULÁRIS KÉMIA BIOPOLIMEREK MOLEKULA SZERKEZETÉNEK KUTATÁSA ANOMÁLIS MOLEKULASZERKEZETEK KIMUTATÁSA A FEHÉRJÉK POSZTTRANSZLÁCIÓS FOLYAMATAINAK ÉS MECHANIZMUSAINAK VIZSGÁLATA (GLIKOZILÁLÁS) GYAKORLATI CÉLOK – ALKALMAZOTT KUTATÁS DIAGNOSZTIKA - PROGNOSZTIKA - MARKEREK (PL. DAGANATOS MEGBETEGEDÉSEK FELISMERÉSE)

ELVÁLASZTÁSTUDOMÁNY ELVÁLASZTÁSI FELADATOK MINTA ELŐKÉSZITÉS ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK EGYIDEJÜ ÉS ÖSSZEHANGOLT ALKALMAZÁS MULTIMODÁLIS – MULTIDIMENZIONÁLIS ANALITIKAI – PREPARATIV

AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI RENDSZER

ANALITICA EST ANCILLA CHEMIAE ? Paradigma váltás a BIOANALITIKÁBAN

MINTA ELŐKÉSZITÉS ÁLTALÁNOS SZEMPONTOK ÉS KÖVETELMÉNYEK A MINTA JELLEMZÉSE A VIZSGÁLANDÓ VEGYÜLET(EK) TULAJDONSÁGAINAK ISMERETE MOLEKULATÖMEG, ALAK, MINŐSÉG (Globuláris-fibrilláris, aggregáció, flexibilitás, belső viszkozitás), SZERKEZET, FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK, OLDÉKONYSÁG, SZOLVATÁCIÓ-HIDRATÁCIÓ, POLARITÁS, p. KA, p. KI HIDRODINAMIKAI JELLEMZŐK (Diffúziós állandó, Stokes-rádiusz), SPEKTROSZKÓPIAI ADATOK, DETEKTÁLHATÓSÁG, BIOLÓGIAI AKTIVITÁS (Enzimatikus, élettani, stb. ) STABILITÁS (Fény, Hő, Idő) ELEKTROKÉMIAI TULAJDONSÁGOK (p. I) IRODALMI ADATOK HASONLÓ SZERKEZETÜ ANYAGOKRA (ADATBÁZIS)

MINTA ELŐKÉSZITÉS A BIOLÓGIAI KÖRNYEZET (MATRIX) JELLEGE Kinyerhető-e a vizsgálandó anyag a változatlan mátrixból, Felszabadítható-e a szilárd fázisból, Csökkenthető-e a mátrix kötésének erőssége, (pl. higítás, p. H, ionerősség, stb. változtatásával) Vannak-e jelen potenciális interferáló vegyületek. AZ INTERFERÁLÓ ANYAGOK VIZSGÁLATA A minta jellemzéséhez hasonlóan.

MINTA ELŐKÉSZITÉS A MINTA ELŐKÉSZÍTÉS IGÉNYEI CLEAN UP - SELECTIVE ENRICHMENT TISZTITÁS IGÉNYE felmerül-e ? (Specifikus detektálhatóság, interferáló anyagok? ) TÖMÉNYITÉS IGÉNYE felmerül-e ? (Oldékonyság, detektálhatóság, ? ) OLDÓSZER CSERE (váltás) igénye felmerül-e ? - Alkalmas-e az eluáló oldószer(elegy) a HPLC-re ? - Alkalmas-e a vizes elúció a detektálásnál ? - Szükséges-e más (illékony) oldószer alkalmazása ?

MINTA ELŐKÉSZITÉS A MINTA ELŐKÉSZITÉS MÜVELETEI FIZIKAI-MECHANIKAI MÜVELETEK MINTAVÉTEL (Random, statisztikai, anatómiai heterogenitás, stb. ) APRITÁS, ÖRLÉS, HOMOGENIZÁLÁS (Késes, Grinder, Potter, Dounce, Ultrahang) SZITÁLÁS, SZÜRÉS, ULTRASZÜRÉS, DIALIZIS CENTRIFUGÁLÁS - ULTRACENTRIFUGÁLÁS KIVONÁS (EXTRAKCIÓ), TÖMÉNYITÉS, SZÁRITÁS

MINTA ELŐKÉSZITÉS A MINTA ELŐKÉSZITÉS MÜVELETEI KÉMIAI MÜVELETEK HIGITÁS, IONERŐSSÉG, p. H VÁLTOZTATÁS HIDROLIZIS (Savas, lúgos, enzimatikus) SZÁRMAZÉK KÉPZÉS (Kromofor csoportok, polaritás változtatás, stb. ) ADALÉKANYAGOK (Ion-pár képzés, detergensek, polaritás változtatás) SPECIÁLIS KÖLCSÖNHATÁSOK (Immuno-affinitás, zárvány-fém komplex)

MINTA ELŐKÉSZÍTÉS AZ ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZER KIVÁLASZTÁSA ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK EGYSZERŰ ELVÁLASZTÁSI ELJÁRÁSOK KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSI MÓDSZEREK ELVÁLASZTÁSI MÜVELETEK ELEKTROMOS ERŐTÉRBEN Elektroforézis - Elektromigráció ELVÁLASZTÁSI MÜVELETEK GRAVITÁCIÓS ERŐTÉRBEN Centrifugálás – Ultracentrifugálás

MINTA ELŐKÉSZÍTÉS EGYSZERŰ ELVÁLASZTÁSI ELJÁRÁSOK SZITÁLÁS, SZŰRÉS, ULTRA(MOLEKULA)SZŰRÉS, DIALIZIS SZÁRÍTÁS (BEPÁRLÁS, VÁKUUM BEPÁRLÁS, FAGYASZTVA SZÁRÍTÁS) SZÉTKRISTÁLYOSÍTÁS (pl. diasztereomer sópárok) KIVONÁS – EXTRAKCIÓ GÁZ-GŐZ FÁZISÚ EXTRAKCIÓ Vákuum, vagy vízgőz desztilláció, Gőztér (head space) analizis, Vivőgázzal (N 2 Ar, He), Kriocsapdával (purge and trap) FOLYADÉK-FOLYADÉK FÁZISÚ EXTRAKCIÓ FOLYADÉK-SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ SZUPERKRITIKUS ÁLLAPOTÚ (CO 2, CS 2) EXTRAKCIÓ

MINTA ELŐKÉSZÍTÉS KIVONÁS – EXTRAKCIÓ FOLYADÉK-FOLYADÉK FÁZISÚ EXTRAKCIÓ Megoszlási egyensúly létrehozása nem elegyedő oldószer (vizes!) fázisok között Szakaszos (pl. kirázás választótölcsérben), Folyamatos (ellenáramú, counter current) technikák FOLYADÉK-SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ Oldószeres, sós, savas kicsapás (precipitáció) Szilárd fázisból történő extrakció Soxhlet eljárás, Szilárd fázison történő extrakció SPE (Solid Phase Extraction)

AZ FOLYAMATOS ELLENÁRAMÚ FOLYADÉK FÁZISÚ EXTRAKCIÓ Countercurrent Flow-Through Coil Centrifuge (Ito et al. 1971)

MINTA ELŐKÉSZÍTÉS FOLYADÉK-SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ OLDÓSZERES, SÓS, SAVAS KICSAPÁS (PRECIPITÁCIÓ – BIOLÓGIAI MINTÁK) Me. OH, CHCl 3 -Me. OH, CH 3 CN, Pr. OH, Aceton, Éter Et. OH (Cohn-féle frakcionálás), hődenaturáció (NH 4)2 SO 4, Na 2 SO 4, PEG, kaprilsav, Rivanol, stb. Triklór ecetsav, perklórsav, foszforwolframsav, szulfoszalicilsav,

SOXHLET KÉSZÜLÉK ELLENÁRAMÚ EXTRAKCIÓ

MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME)

MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME) AZ ÁLLÓ FÁZIS KIVÁLASZTÁSA (TÖLTET, CARTRIDGE) A MINTA KÖLCSÖNHATÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISSAL ? („C” - Si. O 2 - Al 2 O 3 – CN – OH – NH – IEX – RP 2 -18 – HIC – SEC – AFF ) RETENCIÓS ADATOK (HPLC)? SZELEKTIVITÁS AZ ÁLLÓ FÁZISRA? ÁLLÓ FÁZIS HIDRODINAMIKAI JELLEMZŐI (SZEMCSE MÉRET, ELOSZLÁS, ALAK, TÖLTÉS MINŐSÉGE) TÖLTET REPRODUKÁLHATÓSÁGA (BATCH TO BATCH)

SZERVES MINTA (MW<2000 Da) OLDÓDIK SZERVES OLDÓSZERBEN / VÍZBEN | / POLÁRIS KÖZEPESEN APOLÁRIS Me. OH CH 3 CN Et. Ac NPC CIANO DIOL AMINO -NH 2/NH Hexán Heptán CHCl 3 ADS KIESELGUHR KIESELGEL Si. OH FLORISIL Al 2 O 3 RPC C 18 IONOS NEM IONOS (ION-PÁR) KATIONOS ANIONOS POLÁRIS KÖZEPESEN APOLÁRIS IEX CIANO NPC ADS RPC AMINO CIANO SíOH C 18 C 8 -COOH NH 2/NH DIOL FLORISIL CIKLO HEXIL FENIL - CN -SO 3 H -NR 3+ -NH 2/NH Al 2 O 3 CIKLO HEXIL FENIL - CN

MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME) AZ ÁRAMLÓ FÁZIS KIVÁLASZTÁSA (MINTA OLDÓSZERE, MOSÓFOLYADÉK, ELUENS) A MINTA ÖSSZETEVŐINEK OLDÉKONYSÁGA KÖLCSÖNHATÁSOK LÉTREHOZÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISSAL ÉS/VAGY MEGBONTÁSA DIFFERENCIÁLÁS LEHETŐSÉGE (OLDÓSZER ELEGYEK)

SZERVES MINTA (MW>2000 Da) OLDÓDIK SZERVES OLDÓSZERBEN VÍZBEN / IONOS / KATIONOS NEM-IONOS Ion-pár képző ANIONOS RPC WP-BUTIL (C 4) IEX SEC IEX WP-BUTIL (C 4) SEC WP-COOH WP-PEI Sephadex G-25 HEXÁN PUFFER METILÉN KLORID VIZES PUFFEREK METILÉN KLORID ACETONITRIL ACETON METANOL – VIZ METANOL - VIZ

MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISON TÖRTÉNŐ EXTRAKCIÓ (Solid Phase Extraction, SPE, SPME) A SPE ALKALMAZHATÓSÁGÁNAK ÁLTALÁNOS SZABÁLYA AZ ÁLLÓ FÁZIS ERŐSEN POLÁRIS GYENGÉN POLÁRIS-APOLÁRIS A MINTA OLDÓSZERE (MOSÓFOLYADÉK) AZ ELUÁLÓ OLDÓSZER A MINTA ÖSSZETEVŐINEK LEOLDÓDÁSI SORRENDJE Si. O 2 GYENGÉN POLÁRIS (HEXÁN, THF) ERŐSEN POLÁRIS (VIZES PUFFER, Ac. OH, Me. OH) C 18 ERŐSEN POLÁRIS (H 2 O, Ac. OH, TFA) APOLÁRIS (Me. OH, ACN) ELŐSZÖR A LEGAPOLÁRISABB LEGPOLÁRISABB ÖSSZETEVŐK OLDÓDNAK LE

1. Extrelut® NT 2. Vizes alapú minta felvitele 3. Szerves oldószer felvitele (vízzel nem elegyedő) 4. Elúció Lipofil komponensek kinyerése a mintából

Li. Chrospher® ADS Alkyl Diol Silica LC-integrált (on-line) mintaelőkészítéshez

Makromolekuláris összetevők (protein, nukleinsav) Diol felületi réteg Apoláris belső szerkezet Li. Chrospher ADS

Többrétegű héjszerkezetű kromatográfiás állófázis (C 18) vázlatos szerkezete és pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képe.

MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ A SPE MÓDSZER ELŐZETES VIZSGÁLATA SORÁN MEG KELL HATÁROZNI AZ EXTRAKCIÓ OPTIMÁLIS MÓDJÁT, A MÁTRIX MÓDOSÍTÁSÁNAK LEHETŐSÉGÉT, A MEGFELELŐNEK TARTOTT ÁLLÓ FÁZIST (TÖLTET, SZORBENS), A MEGFELELŐNEK TARTOTT OLDÓSZERELEGYEKET (MOSÓ-ELUÁLÓ), A MINTA (MINIMÁLIS-SZÜKSÉGES) TÉRFOGATÁT, AZ ÁLLÓ FÁZIS MÉRETÉT (ÁTTÖRÉSI TÉRFOGAT-MENNYISÉG)

MINTA ELŐKÉSZÍTÉS SZILÁRD FÁZISÚ EXTRAKCIÓ A SPE MÓDSZER OPTIMÁLÁSA REPRODUKÁLHATÓSÁG, VISSZANYERÉS REFERENCIA VEGYÜLETEKKEL, HATÁSOSSÁG MATRIX NÉLKÜL ÉS KOMPLEX (BIOLÓGIAI) RENDSZERBEN, INTERFERÁLÓ ANYAGOK HATÁSÁNAK MODELLEZÉSE, VALIDÁLÁS BELSŐ ÉS KÜLSŐ STANDARDOKKAL (ROBOSZTUSSÁG) HIBA, SZÓRÁS, ÉRZÉKENYSÉG, KIMUTATHATÓSÁGI HATÁR, SPECIFICITÁS MEGHATÁROZÁSA, KÖLTSÉGKIHATÁS, GAZDASÁGOSSÁG BECSLÉSE.

A FOLCH-FÉLE EXTRAKCIÓ Apoláris (lipidek-zsírok) vegyületekre VIZES FÁZISÚ MINTA VIZES 1 TÉRFOGAT (VÉRSZÉRUM, SZÖVET HOMOGENIZÁTUM) Me. OH KLOROFORM-METANOL (1: 1) CHCl 3 16 FORRÁSIG HEVÍTÉS KLOROFORM 8 SZŰRÉS – CENTRIFUGÁLÁS VÁLASZTÓTÖLCSÉRBEN 1% KCl 0, 2 TÉRFOGAT ELVÁLASZTÁS KLOROFORM (ALSÓ) FÁZIS BEPÁRLÁSA ANALIZIS (TLC, HPLC)

POLÁRIS ÉS APOLÁRIS LIPIDEK (ZSÍROK) TLC ANALIZISE EGYDIMENZIÓS KÉT LÉPÉSES ELVÁLASZTÁS 1. - LÉPÉSBEN: CHCl 3 -Me. OH-Ac. OH (35 -25 -4) 2. - LÉPÉSBEN: HEXÁN-ÉTER-Ac. OH (85 -15 -3) ELŐHIVÁS: PMS

TNIM ( ILOP SETEZSÉMRET

PSEUDO-URIDIN MEGHATÁROZÁSA HUMÁN VIZELETBEN A t-RNS SZERKEZETE

MINTA ELŐKÉSZÍTÉS – SPE NUKLEOZIDOK (Ade, Cyt, Gua, Uri, Ψ-Uri) ELVÁLASZTÁSA BORONÁT AFFINITÁSI FÁZISON NH 4 Ac puffer p. H: 8, 8 0, 1 M HCOOH HPLC

MINTAELŐKÉSZÍTÉS - SPE HUMÁN SZÉRUM SAVANYÚ ALFA-1 -GLIKOPROTEIN (AGP) IZOLÁLÁSA ÉS TISZTÍTÁSA HUMÁN SZÉRUM ▼ NEM ELEGYEDŐ FÁZISÚ OLDÓSZERES EXTRAKCIÓ KLOROFORM-METANOL-VÍZ CENTRIFUGÁLÁS ▼ VIZES-METANOLOS FÁZISBÓL FEHÉRJÉK KICSAPÁSA ETANOLLAL CENTRIFUGÁLÁS ▼ FESTÉK-LIGAND (Cibacron Blue) AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA