ELISA understanding the acronym EL EnzymeLinked An enzymes

ELISA understanding the acronym • EL Enzyme-Linked – An enzyme’s activity is used as a “reporter” to test for the presence/amount of a protein of interest. – The enzymatic reaction will produce a colored species.

ELISA understanding the acronym • EL • IS Enzyme-linked Immunosorbent – An antibody or antigen (“immuno”) is adsorbed (“sorbent”) onto the polystyrene wells in which we conduct the test.

ELISA understanding the acronym • EL • IS • A Enzyme-linked Immunosorbent Assay – We could determine the amount of (quantitative assay). – We will use concentration standards to construct a standard curve.

POSSIBILI FORMATI ANALITICI: piastre microtiter In commercio sono disponibili numerosi kit su piastra microtiter a 96 pozzetti, spesso con traccianti enzimatici e rivelazione colorimetrica. Il kit contiene la piastra con l’anticorpo immobilizzato e tutti i reagenti pronti all’uso. E’ necessario disporre di pipette per la dispensazione e di alcune attrezzature (lettore di micropiastre per la misura del segnale ed eventualmente dispensatori, lavatori, . . . )

384 wells 1536 wells

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI La misura della quantità di analita (An) è basata sulla competizione con il tracciante (An*) per un numero limitato di siti anticorpali (Ab). L’equilibrio che si instaura è: KAn An + Ab An-Ab + An* KAn* An*-Ab Le condizioni per l’esecuzione del metodo sono: [An*]i = costante [Ab]i < [An]i + [An*]i

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTO Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Enzima Antigene Tracciante Substrato enzimatico Anticorpo immobilizzato Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione SATURAZIONE Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI segnale Per i metodi competitivi, il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita. concentrazione analita

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI Metodo immunometrico competitivo eterogeneo: il legame dell’analita all’anticorpo viene rivelato indirettamente attraverso la misura del legame del tracciante all’anticorpo. 1 2 tracciante 3 analita aggiunta reattivi 4 Tracciante legato separazione libero legato 1 2 reazione 0 4 Conc. analita 16

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Antigene Enzima Tracciante Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Anticorpo di rivelazione Substrato enzimatico Anticorpo di cattura immobilizzato Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI SATURAZIONE Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH”

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

STRATEGIE DI RIVELAZIONE DI UN ANTICORPO Marcatura diretta Rivelazione mediante un anticorpo secondario marcato Ab anti-specie X marcato Ab ottenuto nella specie X Streptavidina marcata Rivelazione mediante un anticorpo secondario rivelabile con un opportuno reagente Ab anti-specie X biotinilato Ab ottenuto nella specie X

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) DIRETTI INDIRETTI

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO DTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO + Ab monoclonali ani-ferritina + Ferritina presente nel campion/stadards/controllo 60 min 37 °C + 30 min 25 °C Lettura del segnale a 492 nm Colorazione giallo-arancione Ab anti-ferritina marcato con HRP

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO DTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO CARATTERISTICHE DEL METODO • Limite di misura = la più piccola concentrazione in ferritin significativamente differente dal valore dello standard O con una probabilità del 95% = 2 ng/ml • Specificità: ferritina di milza umana 100% di reazione crociata ferritina di fegato umano 112% di reazione crociata ferritina di cuore umano 62% di reazione crociata

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Anticorpo Enzima Anticorpo speciespecifico Tracciante Substrato enzimatico Antigene di cattura immobilizzato Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Saturazione Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

High dose hook effect in solid phase immunoassay to measure antibody.

The Global Pregnancy Testing Market was valued $1121 million in 2015 and estimated to reach $ 1410 million by 2020 growing at a CAGR of 4. 7 %. Pregnancy tests are tests used to detect the presence of reproductive hormones such as Follicle Stimulating Hormone or Luteinising Hormone. Fertility rapid test kits help to find the exact day of ovulation or confirm the presence of menopause in women where as they are used to detect the sperm count.

DISPOSITIVI LATERAL FLOW I dispositivi lateral flow (LFD), spesso denominati “strip”, sono metodi analitici immunocromatografici. I reagenti si trovano normalmente incorporati nel dispositivo, rendendo le strip idonee per un’analisi da campo, grazie alla loro praticità d’uso da parte di chiunque e in qualunque situazione. Sono spesso meno precisi di altre metodiche di screening basate su saggi immunologici come gli ELISA, ma possono essere sufficientemente sensibili, quantitativi ed accurati quando appoggiati ad un sistema di lettura strumentale.

Un tipico LFD è formato da - un sample pad dove viene deposto il campione - un conjugate pad in cui è adsorbito il tracciante, - una membrana dove avviene la reazione di legame del saggio sul quale ci sono due siti attivi, uno per il test e uno di controllo, - ed infine da un absorbent pad responsabile del direzionamento del flusso attraverso la membrana.

POSSIBILI FORMATI ANALITICI: lateral-flow immunoassay Permettono un’analisi qualitativa o semiquantitativa molto rapida: C T S S Negativo Positivo - Il campione viene aggiunto ad una estremità (S) - fluisce lungo la membrana per effetto di capillarità, - Successivamente, si raggiunge la zona di cattura dell’analita (T) e la zona di controllo (C)

Lateral flow test, IMMUNOSTRIP Control line. Antibodies anti -Ig. G adsorbed Antibodies anti-antigen conjugated with enzyme Test line. Antibodies antigen adsorbed

Lateral Flow test, IMMUNOSTRIP The antibodies are binded to their antigen in the sample and the complex antigen-antibody moves by capillarity towards the reaction lines.

Lateral Flow test, IMMUNOSTRIP Antigen binds to the antibodies that are in the test line. Free antibodies bind to the antibodies anti-Ig present in the control line.

LATERAL-FLOW IMMUNOASSAY DETERMINAZIONE SEMIQUANTITATIVA DELLA MICROALBUMINA NELLE URINE Principio immunologico: anticorpi monoclonali specifici per l'albumina umana (immunoglobulina G) Marcatore: oro colloidale Linearità: da negativo a 100 mg/l Intervalli di lettura: - da negativo a 20 mg/l - da 20 a 50 mg/l - da 50 a 100 mg/l - superiore a 100 mg/l Stabilità del colore di reazione: fino a 5 minuti Performance del test: - sensibilità: 95 % a 15 mg/l; 97% a 20 mg/l - specificità: 93% a 15 mg/l; 72% a 20 mg/l - valore predittivo positivo: 97% a 15 mg/l; 84% a 20 mg/l - valore predittivo negativo: 88% a 15/mg/l; 94% a 20 mg/l Stabilità test confezionato: 18 mesi dalla data di confezionamento Temperatura di conservazione del flacone: compresa tra +2 °C e + 30 °C Fattori di interferenza: - nel raccoglitore urine: disinfettanti ad alto potere ossidante - nel campione: presenza di ossitetraciclina (incremento dei valori del 15%) Certificazione ISO 9002 Conformità direttiva 98/79/CEE