ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA Metoda

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

ELISA Metoda Elisa slouží k zjišťování přítomnosti antigenů nebo protilátek v těle n Je založena na specifické interakci mezi antigenem a protilátkou (imunoglobulinem) n

ELISA n Při setkání konkrétního antigenu s příslušným receptorem se rozběhne specifická reakce a B-lymfocyt se začne rychle dělit

Klonální selekce n n Výsledkem dělení jsou dlouhožijící paměťové buňky a krátce žijící tzv. efektorové buňky Efektorové buňky vytváří obrovské množství volných imunogloublinů

Imunoglobuliny n n Protilátky, které jsou produkovány efektorovými buňkami jsou volně v krvi a lymfě Protilátka se váže k antigenu ve svém vazbném místě na principu zámku a klíče

ELISA Metoda Elisa využívá tohoto principu: jestliže se v těle vyskytl virus, objeví se zde také protilátky, které jsou produkovány efektorovými buňkami Touto metodou můžeme tedy ověřit zda má pacient v těle virus nebo ne

Zkoumání přítomnosti viru Pokud chceme zjistil jestli je člověk nakažen virem-např. virem HIV, bude mít v těle proti HIV konkrétní protilátky n V laboratorních podmínkách můžeme provést test ELISA s jehož pomocí zjistíme zda je pacient HIV pozitivní či negativní n

ELISA - Zkoumání přítomnosti HIV v krvi Na dno zkumavky pevně umístíme HIV antigeny Zkumavku polijeme krví pacienta

Navázání protilátek na HIVantigen n n V krvi HIVpozitivního pacienta jsou protilátky proti HIV a ty se naváží na HIV-antigeny Pokud je pacient HIV-negativní nebude mít specifické protilátky proti HIV

Přidání protilátek s enzymem n n Po každém kroku musíme zkumavku vymýt, aby se smyly nenavázané protilátky V dalším kroku přidáme připravené protilátky s enzymem, pro které je antigenem imunoglobulin pacienta

Přidání substrátu n n n V posledním kroku se celý komplex polije substrátem Pokud je zde přítomný enzym, substrát reaguje a změní barvu U HIVpozitivního pacienta zkumavka zmodrá!

Reakce substrátu peroxidase H 2 -donor (substrate) donor (product) oxidation CH 3 peroxidase NH 2 + H 2 O 2 H 2 N CH 3 colourless 3, 3, 5, 5 Tetramethyl. Benzidin CH 3 NH + 2 H 2 O HN CH 3 blue reduction CH 3

Výsledek n n n Vazba mezi antigenem a protilátkou je velmi silná - vydrží každé vymytí HIV-negativní pacient nebude mít ve zkumavce navázanou původní protilátku= další protilátka se nebude moci na ni navázat= substrát nezmění barvu, protože bude chybět enzym Naopak HIV-pozitivní pacient bude mít všechny potřebné složky navázané a přidaný substrát nakonec změní barvu

ELISA u rostlin Pokud chceme zjišťovat přítomnost viru u rostlin využijeme podobného principu Jelikož rostliny neprodukují protilátky, musíme si je připravit u živočichů, kteří mají specifickou imunitu Rostlinný virus vložíme do těla zvířete(v našem případě králíka), ten si vytvoří specifické protilátky, které se mohou využít v metodě ELISA ke zkoumání přítomnosti viru v těle rostlin podle následující animace:

ELISA princip product substrate antibody epitop enzyme aktive centre antigen antibody Solid phase