Elementi di genomica dei Microrganismi Applications of Bioinformatics

Elementi di genomica dei Microrganismi

Applications of Bioinformatics and Biocomputing to Microbiological Research DNA sequencing Bioinformatics and Biocomputing tools Analysis of DNA sequence Expression studies Functional assays 3 D protein structure Gene knockouts Protein-protein interaction

Biology Computer science Bioinformatics Information tecnology Sviluppare Database più complessi in cui è possibile avere libero accesso ai dati, depositarne nuovi (submit) e/o modificarli quelli già presenti Il processo di analisi ed interpretazione dei dati è indicato come “computational Biology”, sub-disciplina all’interno della bioinformatica

This deluge of genomic information has led to an absolute requirement • for computerized databases to store, organize and index the data • for specialized tools to view and analyze the data What is the Grid? Experiments The Grid Computers Sensors Data Scientists Displays Technology that enables persistent shared use of distributed resources – computing, data, visualisation, instruments, networks – without needing to know in advance where these are or who owns them

DATABASE - 1979 un gruppo di biologi e matematici Rockefeller University a New York istituiscono un database in cui memorizzare le sequenze geniche - 1981 European Molecular Biology Laboratory (EMBL) finanziato da alcuni Paesi europei istituisce EMBL data Library Gen. Bank: depositario di sequenze geniche di DNA e di informazioni relative a queste Genbank è un database di sequenze, genomi, proteine Ogni unità è generata dall’immissione diretta delle sequenze da parte dei relativi autori Questa banca dati di biologia molecolare è mantenuta dal National Center for Biotechnology Information (NBCI –http: //www. ncbi. nlm. nhi. gov/entrez/query

Nucleotide sequence databases Le sequenze possono essere deposita in uno dei tre maggiori database • Gen. Bank at the NCBI (http: //www. ncbi. nlm. nhi. gov/entrez) (Americana) • The European Molecular Biology Laboratory ( EMBL) at the Nucleotide Sequence Database at the European Bioinformatics Istitute (EBI) ( http: //www. ebi. ac. uk) (Europea –Heidelberg Germania) • The DNA Database of Japan (DDBJ) at the National Institute of Genetics (http: //www. ddbj. nig. acjp) (Giapponese)

L’insieme dei dati costituiscono “International Nucleotide Sequence Database Collaboration” che scambiano giornalmente le informazioni provenienti da ciascun ente (htt: //www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/collab) ogni sequenza ha lo stesso accession number in tutti i databases Ex NCBI Pub. Med web site is hyperlinked : Gen. Bank, Taxonomy database,

Approccio « substems» per annotation dei genomi Questo sistema è di grande aiuto per i ricercatori riunendo annotazioni genomiche «verticali » invece di quelle orizzontali. Le annotazioni sono riunite da un punto di vista funzionale nell’ambito di strutture biologiche Sono stati sviluppati più di 500 distinti subsystems Ex: metabolic pathways Complex structure Genotype and phenotype associations

1. 2. 3. Steps Strain choice…. now any kind of microrganism From shotgun to finishing Annotation The goal of the genome annotation is to determine the location of specific genes in the genome map: Find ORFs: -look for ATG-stop( alternative s) - over certain size - overlaps - computer based ORF Function - search databases with predicted translated sequences - consider level of similarity and context - domain comparisons -Pfam/Prosite

L’uso di questi dati conservati in un database richiede: • facilità nell’accesso dell’informazione • un metodo per estrarre solo le informazioni necessarie a rispondere ad una specifica domanda Molti database nell’ NCBI sono collegati in un unico sistema “Entrez” che permette l’accesso a differenti database e l’integrazione con altre informazioni contenute in altri database. Ad esempio Entrez Protein databases ha un link con Entrez taxonomy databases http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/

Molecular evolution in bacteria L’analisi del genoma dei procarioti evidenzia un continuo scambio dell’informazione genica mediante meccanismi di trasferimento orizzontale e processi di ricombinazione omologa L’idea che l’evoluzione nei procarioti avviene per divergenza clonale viene rivista alla luce di queste nuove conoscenze che indicano lo scambio genico come “creative force” in questo processo

Il genoma batterico è composto da un parte di genoma conservata “core” , che contiene le informazioni geniche necessarie per le funzioni vitali ( “minimal genome”) ed una porzione indicata “ flexible” (mobiloma) un pool genico che codifica geni addizionale che possono migliorare la vita del microrganismo e garantire in alcuni casi la stessa sopravvivenza !! Questi includono i geni per la resistenza agli antibiotici, fattori di virulenza, produzione di tossine ecc. Mentre il core è una porzione del genomi molto stabile e conservata nelle diverse specie, la parte flexible rappresenta la regione maggiormente variabile, veicolata da elementi mobili come plasmidi, fagi IS, trasposoni coniugativi, Isole di patogenicità, integroni. Dall’analisi di differenti genomi microbici è emerso che più del 20% è costituita da geni acquisiti per trasferimento orizzontale!!!

Il trasferimento orizzontale consente l’ingresso di DNA sia potenzialmente utile che dannoso ed in questo caso viene eliminato!! Nonostante ciò le dimensioni del genoma si mantengono costanti!! Processi di delezioni avvengono frequentemente, eliminando il DNA esogeno Alcuni geni possono essere persi, perché inutilizzati in alcune nicchie e mantenuti e/o acquisiti altri per occupare nuove Es: Geni possono essere persi se le loro funzioni possono interferire con l’adattamento a nuove nicchie ecologiche Ex- Shigella ha perso i geni che codificano Omp. T proteasi di superficie e Cad. A perché la loro espressione attenuavano la virulenza

Three important areas of comparative analysis: 1. Genome structure 2. Coding regions 3. Non conding regions Homology implies common ancestry of two genes or gene products Similarity is what we can measure from alignment of sequences or structures The first step in comparative genomics analysis is often the alignment of two genome sequences Ex. Algorithms/tools: BLASTN (http//www. ncb. nlm. nih. gov/BLASt/) MEGABLAST

1. Genome structure Analizza la struttura globale del genoma: • dimensioni, • geometria e numero dei repliconi, • sequenza nucleotidica, • disposizione genica, • similarità e differenze tra genomi

GENOME SIZE ……

TOPOLOGY

Burkholderia mallei genome Fig. 1. Circular diagrams of chromosome 1 and chromosome 2 in B. mallei. Locations of selected genome features are denoted on seven layers of circles. From the outermost layer 1) CDS in color codes for predicted functional role categories 2) CDS in the other orientation, 3) GC skew 4) IS elements flanking syntenic breaks compared to B. pseudomallei chromosome, 5) IS elements not associated with syntenic breaks 6) Sequence that contain at least one A or T in the repeat unit 7) putative virulence genes. The locations of wcb capsule gene cluster lipopolysaccharide biosynthesis genes, and a single lux. R-type regulator in chromosome 1, plant and animal pathogen-type III secretion system loci, and two pairs of lux. R/lux. Itype regulators in chromosome 2 are shown.

La struttura di differenti genomi può essere comparata in tre livelli: a) Comparison of overall nucleotide statistic b) Comparison of genome structure at DNA level c) Comparison of genome structure at gene level

a) Comparison of overall nucleotide statics genome size, overall (G+C) content, regions of different (G+C) content, codon usage. Il contenuto in CG varia dal 25% al 75% G+C/G+C for leading and lagging strand referred as GC skew Il sequenziamento e l’analisi dei genomi ha evidenziato una forte variabilità nelle dimensioni, organizzazioni circolari e/o lineari e nel contenuto di CG Es. 29% in Borrelia burgdorferi 68% in Deinococcus radiodurans Codon usage Composizione aminoacidica di una specie

a) Comparison of overall nucleotide statics ex: two Helicobacter pylori strains J 99, 26695, have about the same overall (G+C) content but they each have several regions of different (G+C) content that are strain- specific (horizontal gene transfer) Il contenuto di G+C varia dal 25% al 75% nei batteri ed è correlato con la crescita in aerobiosi: batteri aerobi hanno un maggiore contenuto in G+C rispetto a quelli che vivono in anaerobiosi

b) Comparison of genome structure at DNA level Chromosomal breakage and exchange of chromosomal fragments are common mode of gene evolution Il termine “synteny” originalmente usato per indicare loci genici su uno stesso cromosoma, adesso, è, anche riferito a due regioni di due genomi che mostrano una forte similarità !! L’identificazione e l’analisi delle “synteny regions ” forniscono informazioni sull’organizzazione e sull’ evoluzione dei genomi

b) Comparison of genome structure at DNA level Similarity of sequence and conservation of chromosomal fragments in those regions ……are likely to be related by common descent. 1. the length of the regions and percentage of DNA sequence identity between conserved syntenic regions 2. Distribution of these regions along the genomes 3. Gene order of conservated regions 4. Content of DNA repeats

c) Comparison of genome structure at gene level Chromosomal breakage and exchange of chromosomal fragments cause distruption of gene order and “gene order”correlates with evolutionary distance These studies analize • the conservation of gene order • conservation of relative orientation of gene pairs • generate plots of positions in two species This plots suggest hot spots of genome rearrangements I riarrangiamenti genomici rappresentano un problema per valutare le distanze geniche tra genomi. Computational tools quali GRIMM (http: //www-cse. ucsd. edu/groups/bioinformatics /GRIMM/index. html), consentono di valutare una serie di riarrangiamenti probabilmente associate con la conversione di un genoma in un altro utilizzando l’analisi di distinti “gene order “

2. Comparative analysis of coding regions sequenza - struttura - funzione genomica funzionale: tecnologie innovative rivolte ad assegnare rapidamente e ed efficacemente funzioni geniche alle sequenze La bioinformatica fornisce un mezzo rapido ed efficace per assegnare una funzione Three important areas of comparative analysis: genica presunta 1. Genome structure 2. Coding regions 3. Non conding regions

2. Comparative analysis of coding regions Involves: 1. the identification of gene-coding regions 2. comparison of gene content 3. comparison of protein content

Predizione genica ed annotazione numerosi programmi bioinformatici sono utili alla identificazione di geni all’interno di una sequenza di DNA. Predizione genica: identificare le regioni di DNA che codificano le proteine Annotazione: definire la funzione dei geni (o ORF) predetti: - la localizzazione dei geni (la loro posizione nella sequenza), v la struttura degli stessi ( regioni regolatorie predette), v l'eventuale match con sequenze proteiche o di RNA note.

Identificazione di orf funzionali utilizza i programmi di bioinformatica L’identificazione di una orf funzionale richiede un codone di inizio ed una di fine. La ricerca delle orf richiede l’analisi nei 6 schemi di lettura - informazione sulla funzione di un nuovo gene ORF Finder (Open Reading Frame Finder) http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf. html Ex. PASy Home page http: //www. expasy. org/tools/dna. html

Figure 4. 1. Open reading frames of 100 bp encoded on a 10 -kb fragment of the Escherichia coli K 12 genome from 3435250 to 3445250. The figure was generated using the program ORF finder at the NCBI web site (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf. html). The six horizontal lines represent frames 1, 2, 3, 1, 2, and 3, respectively. ORFs in each frame are shown as green boxes.

La predizione genica è più semplice nei procarioti che negli eucarioti Nei procarioti, poiché non hanno introni, le sequenze codificanti le proteine sono facilmente identificate come le open reading frames più lunghe. 1 1000 2000 3000 4000 5000 +1 +2 +3 -1 -2 -3 Ci possono essere diversi start codon potenziali in un gene di procariote: 1) L’m. RNA può essere policistronico 2) Alcune volte nei genomi procarioti si trovano geni sovrapposti. 3) Il genoma procariotico è costituito per la maggior parte da regioni codificanti (ORF) programma DNA STRIDER

Un test per l’identificazione di geni si basa sul codon usage, cioè sull’utilizzo preferenziale e non casuale di codoni nelle ORFs espresse di un organismo. programma DNA STRIDER rappresenta la posizione dei codoni comuni (O=optimal), meno comuni (S=suboptimal), rari (I) ed unici (U=unique + i codoni di STOP) Ovviamente il gene è rappresentato dai codoni più comunemente usati.

Protein sequence databases Il database di sequenze proteiche è ottenuto in gran parte dalla traduzione delle sequenze depositate nei tre sequencedatabase: Gen. Bank, EMBL, DDBJ. NCBI protein database contiene un set completo e semplice di proteine Ciascuna sequenza proteica è riferito ad uno specifico gene Gene prediction historically had been one of the most important and complex aspects of computational biology !! The main problem is getting the correct protein set e. i. correctly predicting the protein-coding regions in DNA sequences for which Theisresponsibility the correctness of the sequence and its there no experimentalfor evidence!!!!!! annotations rests with the submitter!!!! Ex. Pa. Sy web site: http: //www. expasy. org/alinks. html

Protein families database of alignments and HMMs Pfam è una banca dati di famiglie proteiche accomunate da elementi strutturali e funzionali. Ogni entry è caratterizzata da: famiglia raggruppa sequenze proteiche accomunate dagli stessi domini, dominio definisce unità strutturali che possono essere presente in famiglie differenti, repeat raggruppa elementi funzionali attivi e presenti in copie multiple in proteine globulari, motivo include pattern che compongono blocchi strutturali non associati a proteine globulari.

LINK A PFAM 1 2 3

PSORT

La genomica comparativa: • compara due o più genomi per individuare regioni simili o differenti • studia la biologia dei singoli genomi Tools informatici innovativi BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) algoritmo sviluppato nel 1990 da David Lipman

ANALISI COMPARATIVA Rappresenta uno degli approcci bioinformatici più rilevanti per la caratterizzazione funzionale delle sequenze nucleotidiche e proteiche. la funzione di un gene o di una proteina può essere predetta basandosi sul confronto di un certo numero di sequenze simili relative allo stesso o a diversi organismi. inoltre consente di: - stabilire le relazioni evolutive tra differenti microrganismi - ipotizzare l’esistenza di un comune antenato

Sequenziamento di DNA su larga scala Traduzione della sequenza in tutti e sei i frame di lettura Ricerca di similarità nei database di sequenze proteiche Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) Translated • Translated query vs. protein database (blastx) • Protein query vs. translated database (tblastn) • Align two sequences (bl 2 seq) Protein • Protein-protein BLAST (blastp) Utilizzo di programmi di predizione genica per localizzare i geni Analisi delle sequenze regolative dei geni

Selecting the BLAST Program The BLAST search pages allow you to select from several different programs. Below is a table of these programs. Program Description blastp Compares an amino acid query sequence against a protein sequence database. blastn Compares a nucleotide query sequence against a nucleotide sequence database. blastx Compares a nucleotide query sequence translated in all reading frames against a protein sequence database. You could use this option to find potential translation products of an unknown nucleotide sequence. tblastn Compares a protein query sequence against a nucleotide sequence database dynamically translated in all reading frames. tblastx For identifying nucleotide sequences similar to the query based on their coding potential Please note that the tblastx program cannot be used with the nr database on the BLAST Web page because it is computationally intensive.

L’analisi dei "motivi funzionali“ sono utili per identificare la funzionalità della proteina A volte bastano solo un paio di aminoacidi per potere assegnare una caratteristica funzionale ad una proteina (ad esempio un sito di glicosilazione). Queste caratteristiche si riflettono, in genere, in porzioni conservate nella sequenza aminoacidica della proteina che è possibile individuare attraverso l'allineamento multiplo delle sequenze.

Analizzando allineamenti di sequenze a coppie non si è in grado di definire quali siano tra i residui conservati quelli che risultano più importanti per la funzione della proteina. v Invece se si analizza un allineamento multiplo è possibile misurare la variabilità relativa di ciascuna delle posizioni all’interno del multiallineamento. individuazione siti conservati collezione di sequenze omologhe allineamento multiplo Un multiallineamento può essere più o meno informativo a seconda delle sequenze che lo compongono; ad es. se si allineano sequenze molto simili si avrà poca informazione perché non si potranno individuare i residui “veramente importanti”. Spesso invece è più informativo analizzare sequenze differenti provenienti anche da specie differenti.

Tutta l’informazione di un multiallineamento può essere contenuta nel suo profilo il quale, sulla base degli aminoacidi rappresentati, attribuisce a ciascuna colonna (allineamento) il punteggio relativo a ciascuno dei 20 AA.

Clusta. W multiple sequence alignment

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) is “immune system” that control invasions of viruses and plasmids in archea and bacteria!! CRISPR systems: acquired, heritable, sequence –specific “adaptive “immunity CRISPR present a curious repeat structure found in many prokaryotic genomes They show characteristics of both tandem and interspaced repeats. They have been described in a wide range of prokaryotes, including the majority of Archae and many Eubacteria CRISPRs utilizza small non-coding RNAs per la difesa ed agisce con le proteine Cas

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) A CRISPR locus is mainly characterized by : • Direct Repeat (DRs) and Spacers : A CRISPR is a succession of 24 -47 bp sequences called Direct Repeat (DRs) separated by unique sequences of a similar length (spacers). Sometimes, at one end of the CRISPR, the DR is not totally conserved, it is called degenerate DR. • A leader sequence : the CRISPR locus is generally flanked on one side by a common leader sequence of 200 -350 bp, • A family of Cas genes : CRISPR-associated genes are genes always found closely linked to the repetitive sequences. 6 -20 cas genes usually in close proximity to one array

CRISPRs: genetic memory banks • short, direct repeat sequences: there are 12 families of CRISPR repeats based on sequence and secondary structure • the variable sequences , called spacers, are derived from viruses, plasmids and other invaders and confer immunity against the corrisponding invader. • CRISPR locus transcripts are processed to generate small cr. RNAs

Ø“core”cas genes (1 -6) are present in a wide array of organisms cas 1 and cas 2 appear to be universal Ø one or more of the nine sets of subtype-specific cas genes Øauxilary Cmr module Csa (only archea), Cst, Csh and Csm subtype are common in archea Cas system are disseminate by horizontal gene Transfer Cas protein sequences indicate potential funtions as Nuclease, helicase RNA binding proteins

Cas protein systems

CAS genes codificano le proteine che agiscono in CRISPR RNA processing and/or DNA silencing, e sono localizzate vicine sul genoma. CAS proteins spesso contengono RNA- or DNA binding domains, helicase motif and endo or exonuclease domains. Non è noto il meccanismo con cui i CRISPR scelgono il DNA esogeno da integrare

Streptococcus pyogenes

è un patogeno strettamente umano- non sono noti altri reservoir, responsabile di:

• Fig. 1. Circular representation of the S. pyogenes strain SF 370 genome. • M 1 serotype: test sierologico e sequenza del gene emm 1 Outer circle, predicted coding regions transcribed on the forward (clockwise) DNA strand. Second circle, predicted coding regions transcribed on the reverse (counterclockwise) DNA strand. Third circle, stable RNA molecules. Fourth circle, mobile genetic elements: bacteriophage; blue, transposons/IS elements; light cyan, transposons/IS elements ( 10% of the total genome) Fifth circle, known and putative virulence factors: purple, previously identified ORFs; brown, ORFs identified as a result of genome sequence. The lines in each concentric circle indicate the position of the represented feature. Colors: Ex: dark gray, amino acid transport and metabolism; light gray, carbohydrate transport and metabolism; green, cell division and chromosome portioning; violet, DNA replication, recombination and repair; yellow, energy production and conversion; light pink, function unknown; rose, general function prediction only; purple, virulence factors; brown, newly identified virulence factors; blue, transposons/IS elements.

Genoma dello S. pyogenes • Recentemente sono stati sequenziati gli interi genomi di diversi ceppi di S. pyogenes con differenti proprietà sierologiche e di virulenza. Un carattere distintivo è la presenza di genomi fagici completi, che costituiscono il 10% del genoma totale. Sono i fagi i protagonisti del trasferimento genico orizzontale in S. pyogenes, e quindi della sua complessiva evoluzione, con un continuo emergere di nuovi cloni con nuove caratteristiche e nuovi profili di virulenza.

S. pyogenes sono divisi in due gruppi sulla base delle sequele post-infezione: Gruppo I : associati alla febbre reumatica, infezioni delle gola, infezioni invasive M-type 1, 4, 12, 25 (class I M protein) Gruppo II associati alle forme di gromerulonefrite acute, piodermiti ed infezione della pelle con i type M 2, 49, 56, 57 e 60 (class II M protein) e contengono il fattore SOF (serum opacity factor) http: //www. cdc. gov/ncidod/biotech/strepblast. htm

Bacteriophages • I geni che codificano per “superantigen-like protein” sono spesso localizzate su elementi genici mobili/fagi ipotizzando una loro diffusione mediante trasferimento orizzontale • contiene la tossina C codificata dal gene spe. C ( tossina eritrogenica ) associata ad un batteriofago “phage 370. 1” • phage 370. 2 veicola due geni “ superantigen-like genes “ indicati spe. H/I • phage 370. 3 veicola due geni coinvolti nel trasferimento orizzontale e virulenza

Uno dei sistemi di regolazione maggiormente studiati in Streptoccoccus pyogenes a due componenti è cov. R-cov. S (Cov control of virulence) geni di virulenza cov. S-cov. R • peptidi cationici antimicrobici 15 % del genoma • livelli bassi di p. H • alte temperature P cov. S • variazione della concentrazione ionica di Fe o Mg² Regolatore di risposta Sensore chinasi P cov. R

Horizontal Gene Transfer

Plasmid is very compact - little "junk" genetic material, compared to chromosome Plasmids carry genes that have either an essential function (such as replication, maintenance or transfer) or accessory functions (such as those that contribute to the obvious phenotype of the host and enable it to adapt to specific environmental changes). Although they have their own genes for the initiation and regulation of replication, they are absolutely dependent on host cell for replication process (need basic enzymes, nucleotides, and energy).

Functions encoded by Plasmid Il microrganismo che contiene un plasmide che conferisce un “selective advantage”, sopravvive e garantisce la sopravvivenza della specie I plasmidi consentono ai batteri di occupare una grande varietà di nicchie ecologiche Nomenclature p. BR 322 was constructed by Bolivar and Rodriguez da Col. E 1 plasmid p. BR 325 is p. BR 322 con chloramphenicol resistance gene inserted

R- Plasmids

Functions of the ori region • Host range - narrow or broad host ranges Col. E 1, p. BR 322, p. ET, p. UC: narrow host ranges (E. coli, Salmonella, Klebsiella) RK 2, RS 1010: broad host ranges (Gram-positive and gram-negative bacteria) Broad-host-range plasmids encode all of their own proteins required for replication initiation

Functions of the ori region-Regulation of copy number I plasmidi si replicano con due modalità: • quelli di maggiori dimensioni si replicano in maniera coordinata con il cromosoma batterico e si definiscono sottoposti a “controllo stringente” , sono presenti una o poche copie per cellula • quelli di piccole dimensioni si replicano in maniera indipendente dalla replicazione batterica e si definiscono a “controllo rilassati”, sono presenti in molte copie –fino a 1000 per batterio Stringent - low copy number (F factor) Relaxed - high copy number (p. BR 322 - 16 copies; p. UC 18 - 30 to 50 copies)

Regulation of replication of Col. E 1 -derived plasmid Replication regulated by an RNA replication no replication RNAI e RNAII sono complemetari Per le prime 108 bp di RNA II -più alta la concentrazione dei plasmidi maggiore quantità di RNA I e rop

Caratteristiche essenziali dei vettori plasmidici: 1) Origine di replicazione 2) Marcatore di selezione che permette ai batteri trasformati di crescere su terreno selettivo 3) Regione adatta ad inserire il DNA da clonare (sito multiplo di clonaggio o poly-linker)

Controllo del numero di copie I plasmidi possono controllare il numero di copie regolando l’inizio della replicazione plasmidica L’inizio della replicazione può essere controllata regolando: • La disponibilità del primer necessario a innescare la replicazione del DNA plasmidico • La disponibilità di proteine essenziali alla replicazione • La funzionalità di proteine essenziali alla replicazione Rnasi H RNA II ori RNA I rop La replicazione plasmidica inizia dalla ori ed è innescata da un primer a RNA (RNA II), trascritto da un promotore situato 550 bp a monte della ori. Gli ibridi DNA: RNA formati dal filamento di DNA e dall’RNA II nascente, costituiscono un substrato per la Rnasi H che taglia l’ibrido e fornisce l’OH al 3' per la replicazione del DNA.

La maturazione dell’RNA II è controllata dall’RNA I, trascritto sul filamento opposto della stessa regione di DNA e, quindi, complementare all’RNA II. L’appaiamente tra l’RNA II e l’RNA I compete con l’appaiamento tra l’RNA II e il filamento stampo, riducendo la frequenza di inizio della replicazione. Il prodotto d’espressione del gene rop, inoltre, stabilizza il complesso RNA I: RNA II, riducendo ulteriormente la frequenza di inizio. Rnasi H RNA II ori RNA I Il numero di copie dei plasmidi, quindi, è alterato da -mutazioni che destabilizzano il legame tra il filamento stampo e l’RNA II - mutazioni che stabilizzano il complesso RNA I / RNA II -mutazioni che aumentano la disponibilità della proteina Rop o dell’RNA I rop

Mutazione nel plasmide Col. E 1 Per aumentare il numero di copie per cellula di plasmidi p. MB 1/Col. E 1 si può intervenire in diversi modi RNAI Ridurre i livelli di trascrizione dell’RNAI, per es. introducendo mutazione nella sequenza del promotore Proteina Rop La delezione del gene Rop aumenta di 25 - 50 il numero di copie per cellula • i plasmidi di prima generazione (es. p. BR 322) sono presenti in 15 -20 copie per cellula • i plasmidi con un replicone p. MB 1/Col. E 1 modificato, privi del gene rop, hanno un numero di copie molto più elevato (>500 per cellula)