ELEMENTI DI ANALISI CHIMICA E STRUMENTALE FABIO MURENA

Chimica analitica La chimica analitica è la branca della chimica che copre le attività volte all'identificazione, alla caratterizzazione chimico-fisica e alla determinazione qualitativa e quantitativa dei componenti di un determinato campione. Terminologia: • campione: l'oggetto della procedura analitica • analita: la sostanza d'interesse nella determinazione analitica • matrice: i costituenti del campione diversi dall'analita (esempio: suolo) • metodo: la procedura analitica di determinazione, può essere standard o non ufficiale • analisi qualitativa: rivela la presenza e l'identità chimica dell'analita in un campione • analisi quantitativa: stabilisce in termini numerici la quantità di uno o più analiti in un campione • limite di rivelabilità: è la minima quantità di analita determinabile per mezzo di una tecnica analitica • sensibilità: è la variazione di quantità di analita apprezzabile in funzione della tecnica analitica impiegata • standard: materiale, campione, miscela di riferimento

Analisi qualitative e quantitative Analisi qualitative Indicano se una specie chimica è presente o meno in una matrice Analisi quantitative Danno anche l’informazione sulla quantità di specie presente (concentrazione)

Elementi di una analisi quantitativa • • • Accuratezza Incertezza Campo di misura Limite di rilevabilità Selettività Frequenza Tempi caratteristici Sensibilità Taratura Calibrazione

1 Schema di una analisi Si misura una proprietà fisica (es. assorbimento o emissione di luce, conducibilità, corrente) o chimica (ossidabilità o riducibilità) 2 3 Il risultato dell’analisi (RISPOSTA O SEGNALE) dipende dalla NATURA e dalla CONCENTRAZIONE dell’analita Si usa una relazione matematica (calibrazione) per ottenere dalla RISPOSTA la CONCENTRAZIONE dell’analita.

Il risultato di un’analisi chimica è un’informazione costituita da: • valore numerico • unità di misura • incertezza …. T, P e tempo di mediazione per analisi gas

Precisione Accuratezza Incertezza Accuratezza o Esattezza Differenza tra media delle misure e valore reale Variazione intorno alla media di più Precisione o ripetibilità misure ripetute espressa come deviazione standard Incertezza = media / dev standard Per determinare l’accuratezza di un metodo analitico si può ricorrere a: - materiali di riferimento certificati - confronto con altri metodi d’analisi standard - intercalibrazione tra laboratori diversi

Campo o Intervallo di misura Campo di misura Intervallo tra concentrazioni nominali minima e massima che l’analizzatore può misurare Il campo di misura è delimitato da: • Limite di rilevabilità (inferiore) • Limite di saturazione o abbassamento della sensibilità (superiore) Il campo di misura NON va da ma da 0 a infinito Limite inferiore di rilevabilità a Limite superiore

Campo o Intervallo di misura Strumento di misura: righello Campo di misura : da 1 a 140 mm

Altre caratteristiche di un analizzatore o metodo di analisi Selettività Capacità di un metodo analitico di non risentire della presenza d’interferenti o d’altri componenti diversi dall'analita in esame. Frequenza di campionamento/analisi Numero di campionamenti / analisi nell’unità di tempo [Hz]

Tempi caratteristici (per analizzatori in continuo) Tempo di risposta Tempo di ritardo

Definizione di standard e bianco standard campione a concentrazione nota della specie da analizzare bianco campione privo della specie da analizzare Gli standard vanno possibilmente realizzati con la stessa matrice del campione da analizzare ma privo dell’analita. Ad esempio: soluzione acquosa soluzione organica terreno delle stesse caratteristiche …… Gli standard si preparano in laboratorio o si acquistano presso aziende certificate

Limite di rilevabilità inferiore Definizione La minima concentrazione di analita che produce un segnale significativamente diverso da quello del bianco ovvero la concentrazione corrispondente al minimo segnale significativo Segnale significativo è un segnale vicino a quello del bianco, ma da esso significativamente differente, e quindi assegnabile con certezza all'analita sulla base di un criterio specifico

Definizione dei limiti inferiori del campo di misura In funzione del criterio scelto per definire il limite di rilevabilità se ne possono valutare due LOD o LDR (limit of detection) (limite di rilevabilità) LOQ o LDQ Livello minimo per la rilevabilità della specie Livello minimo per la valutazione (limit of quantification) quantitativa della concentrazione (limite di quantificazione) della specie con il medesimo livello di incertezza del metodo

Limite di rilevabilità LOD o LDR E’ la concentrazione media, ottenuta da una serie di analisi, dell’analita minima per la quale si verifica che = media delle misure del campione sia maggiore in maniera statisticamente significativa di = media delle misure di “bianco = dev standard dei campioni di bianco t = variabile t-student n 1 = misure di bianco n 2 = misure del campione Note media e dev standard delle misure di bianco il risultato non è univoco: dipende da: livello di probabilità (t) e da n° di misure del campione Generalmente si assume come livello di probabilità il 99%

Valutazione del Limite Minimo di Rilevabilità (LOD) da misure di bianco 1. si fanno n 1 misure di bianco 2. si calcola la media e la dev standard delle misure di bianco 3. si stabilisce un intervallo di confidenza in corrispondenza del quale si vuole valutare il limite minimo di rilevabilità (99%) 4. si calcola il LOD in funzione del numero di analisi che si vuole fare (n 2)

Media bianco = 0. 33 mg/L Dev. standard bianco = 0. 89 mg/L LOD= 0. 33 +3. 5 mg/L LOD= 0. 33 + 2. 1 mg/L

Calcolo pratico di LOD e LOQ Limite di rilevabilità Limite di quantificazione

Rappresentazione grafica di LOD e LOQ LOD (c’è un significativo overlap delle due pdf) (non c’è overlap) LOD

Intervalli definiti da LOD e LOQ C < LOD Zona inferiore a limite di rilevabilità C≠ 0 Analisi qualitativa C = X udm Analisi quantitativa Zona di rilevazione Zona di quantificazione C 0 LOD Limit of detection LOQ Limit of quantification

Suddivisione del campo di Concentrazioni LOD 0 C = X udm Analisi quantitativa Zona di quantificazione Analisi qualitativa C < LOD C≠ 0 Zona di saturazione Analisi quantitativa LOQ C [udm] Limite di saturazione

TARATURA e CALIBRAZIONE • La taratura è una procedura di caratterizzazione di uno strumento di misura che ha come scopo la definizione delle caratteristiche metrologiche di uno strumento di misura. • La calibrazione è l'operazione in cui uno strumento di misura viene regolato in modo da migliorarne l'accuratezza. L'operazione richiede il confronto con delle misure di riferimento prodotte utilizzando uno strumento campione. È necessario evitare di confondere la taratura con la calibrazione: mentre la taratura è un'operazione che permette di definire tutte le caratteristiche metrologiche di uno strumento, la calibrazione ha come obiettivo di rendere lo strumento più accurato (avvicinare la misura al valore reale). La calibrazione è una operazione routinaria (oraria, giornaliera, settimanale, mensile …). La taratura è una operazione occasionale

TARATURA: caratteristiche metrologiche Le caratteristiche metrologiche sono tutte quelle caratteristiche proprie di un sistema di misura che: • definiscono i limiti entro i quali è possibile fare una misura; • concorrono nella definizione della precisione strumentale. Al primo gruppo si possono ascrivere ad esempio: il campo di misura, la temperatura di funzionamento, la risposta caratteristica … Al secondo gruppo appartengono tutte quelle caratteristiche possono contribuire nella definizione dell'incertezza di misura del sistema e dunque, in generale, la sua precisione; esempio: l'accuratezza; la ripetibilità; la linearità; l'isteresi; la stabilità; la risoluzione.

METODOLOGIE di TARATURA Taratura per confronto In questa metodologia, all’apparecchio da tarare (tarando) è fatta misurare la medesima grandezza che si fa misurare all’apparecchio di riferimento (campione). La precisione del tarando è desunta dal confronto dei due risultati di misura. Esempio: Un manometro può essere tarato collegandolo ad un circuito idraulico dove è stato installato anche un manometro "campione". In questo caso la medesima grandezza, la pressione, è misurata dai due strumenti, e l'analisi delle differenze dei due rilievi permette di valutare la precisione del tarando. Taratura per sostituzione In questa metodologia di taratura, lo strumento campione è o genera direttamente la grandezza che si fa misurare al tarando. La precisione del tarando è desunta dal confronto tra il valore nominale della grandezza generata e i risultati di misura del tarando. Esempio: Una bilancia può essere tarata effettuando delle misure su dei pesi "campione". In questo caso il campione stesso genera una grandezza di valore nominale, il peso, e la valutazione della precisione del tarando scaturisce dall'analisi della differenza tra la lettura sulla bilancia e il peso nominale del campione.

TECNICHE DI CALIBRAZIONE • standard esterno • standard interno o aggiunto

Differenze tra standard interno e standard esterno La principale differenza tra le due tecniche è che nella tecnica dello standard esterno le operazioni di calibrazione ed analisi sono completamente separate. Avvengono su campioni diversi e in momenti diversi. Nella tecnica dello standard esterno, invece, le due operazioni avvengono in parte in modo separato e in parte simultaneamente.

Standard esterno • Si usano soluzioni/miscele standard che contengono quantità note e differenti di analita • Vengono analizzate separatamente dal campione per costruire le curve di calibrazione che si ottengono riportando in grafico la grandezza misurata (segnale strumentale) per una serie di soluzioni di standard a concentrazione nota • L’intervallo di concentrazioni dell’analita contenuto nelle soluzioni standard deve contenere i valori di concentrazione che ci aspettiamo nei campioni Può essere utilizzato quando: • I componenti della matrice del campione non causano interferenza • Si conosce la composizione della matrice (si possono preparare le soluzioni standard in matrici simili a quelle da analizzare)

Schema di analisi con standard interno e esterno Curve di calibrazione con standard esterni per n analiti Standard esterno Standard interno Curva di calibrazione per lo standard interno Analisi del campione con aggiunta dello standard interno Analisi del campione tal quale Check calibrazione (span) Calcolo concentrazione

Esempi di curve di calibrazione S S C C S C

CREAZIONE DI UNA CURVA DI CALIBRAZIONE (per std interno e std esterno) 1 Si realizza un diagramma “risposta strumento contro concentrazione” attraverso una serie di analisi di miscele standard (a concentrazione nota) 2 La relazione “risposta strumento contro concentrazione” viene espressa mediante un’equazione in molti casi lineare y=a+bx. Mediante un’analisi di regressione (minimizzazione degli scarti quadratici) si calcolano i parametri: a (intercetta) e b (pendenza)

Intervallo ottimale dove effettuare la misura e quindi la curva di calibrazione Limit of linearity

NO! estrapolazione Uso della curva di CALIBRAZIONE Tecnica dello standard esterno Ottenuta la curva di calibrazione si fa un’analisi del campione e si determina la concentrazione incognita dalla equazione della curva di calibrazione nota la risposta dello strumento Risposta strumento C misurata Se la risposta dello strumento è al di fuori dell’intervallo dei punti della retta di calibrazione. Bisogna aggiungere nuovi punti attraverso una nuova calibrazione non estrapolare!

ESEMPIO : Costruzione di una curva di calibrazione Analizzare soluzioni di benzene concentrazioni attese di 100 -200 ppm Si preparano (acquistano) e analizzano 6 soluzioni standard di benzene concentrazione da 40 a 300 ppm Risposta (m. A s) 0, 5 1 1, 9 2, 4 3, 1 5, 1 R 2 = 0, 9793 5 Risposta (m. A s) C (ppm) 40 60 100 160 210 300 6 4 3 2 1 0 0 200 ppm Retta di calibrazione 400

ESEMPIO : Utilizzo di una curva di calibrazione Si analizza una soluzione di cui si vuole valutare la concentrazione di Benzene Risposta (m. A s) Il risultato dell’analisi è 1, 9 (m. As) 6 5 4 3 2 1 0 R 2 0 Dalla equazione della retta di calibrazione = 0, 9793 200 400 ppm N. B non abbiamo usato il dato sperimentale a 1. 9 m. As C (ppm) 40 60 100 160 210 300 Risp (m. A s) 0, 5 1 1, 9 2, 4 3, 1 5, 1

Calibrazione – tecnica dello standard interno • Si usa soprattutto in cromatografia • Non si usa in analisi continue (molto comuni in inq. atmoserico) • Si sceglie una sostanza (standard interno) che verrà aggiunta in quantità nota ai campioni da analizzare • Si effettuano delle misure di campioni in cui sono presenti in quantità nota sia lo standard interno che i composti che vogliamo analizzare • Si ottengono delle curve di calibrazione sia dei composti da analizzare che dello standard interno Composti da analizzare segnale Standard interno Composto da analizzare Concentrazione

Scelta dello standard interno • dal punto di vista chimico deve essere sufficientemente diverso dall’analita, in modo da poter essere determinato, nel medesimo esperimento, senza interferire nella misura dell’analita; • deve avere un comportamento analogo all’analita, in modo che il suo • recupero rifletta quello dell’analita stesso; • non deve essere tossico o pericoloso; • deve essere economico e facilmente reperibile.

Calcolo della concentrazione tecnica dello standard interno Note le rette di calibrazione si possono definire dei fattori di risposta sia dei composti da analizzare che dello standard interno F = fattore di risposta, S= segnale i = composto da analizzare, s = standard interno Rapportando le due espressioni si ottiene Si può definire un fattore di risposta relativo tra standard e composto i

Calcolo concentrazione Tecnica dello standard interno Noto il fattore di risposta relativo Fsi si analizza il campione incognito nel quale si è aggiunta una quantità nota di standard esterno si conosce Cs, oltre alla risposta dello strumento per i e s : S i e Ss e si riutilizza la formula precedente per calcolare la concentrazione Ci • In quanto tutti gli altri termini sono noti

Confronto tecnica dello standard interno/esterno Vantaggi standard interno vs standard esterno: - Il risultato analitico non è affetto da eventuali variazioni che possono verificarsi tra l’analisi effettuata in fase di calibrazione e analisi effettuata sul campione in quanto specie incognita e standard interno vengono analizzati insieme nel campione Svantaggi standard interno vs standard esterno: - Maggiore manipolazione dei campioni da analizzare - Contaminazione dei campioni da analizzare La tecnica più frequentemente utilizzata è quella dello standard esterno

Metodo delle aggiunte standard (standard interno)

Curve di calibrazioni non lineari 0 200 Non sempre la ppm migliore curva di calibrazione è una retta. In questo caso i dati sono fittati meglio da una relazione quadratica 400 5 Area (mv s) 6 5 4 3 2 1 0 0 200 ppm La procedura è analoga a quella vista per equazione lineare 400

Sensibilità SENSIBILITÀ definizione: la pendenza della curva di calibrazione in corrispondenza della concentrazione a cui si sta lavorando. 5 Area (mv s) Se la curva di calibrazione non è una retta la risposta dello strumento cambia nel campo di misure effettuato Sensibilità costante 4 La sensibilità è più bassa 3 2 1 0 0 200 ppm 400

Sensibilità 5 media Area (mv s) 4 sensibilità nulla 3 2 1 alta 0 0 200 400 ppm Quando la sensibilità tende a zero si arriva alla saturazione

CALIBRAZIONE SPAN standard esterno Misura di controllo molto frequente fatta su un campione standard concentrazionedell’analita pari a 80 -90% del limite superiore di analisi Si effettua in genere all’inizio e alla fine di una serie di analisi Se la misura dello span si discosta poco dalla curva di calibrazione la procedura di analisi non necessita di una nuova calibrazione

Schema delle operazioni di calibrazione ed analisi Standard esterno Calibrazione NO OK Analisi Calibrazione Risultati validi OK NO Risultati analisi Non validi

Frequenza delle operazioni di calibrazione La calibrazione in genere viene fatta su almeno 5 punti La calibrazione SPAN è fatta su un solo punto (80 -90% limite superiore del campo di misura La frequenza delle operazioni dipende dalla stabilità della procedura di analisi o dell’analizzatore Una calibrazione va fatta prima e dopo una serie di analisi

Frequenza delle operazioni di calibrazione Regole generali Nel monitoraggio dell’inquinamento atmosferico si fa una calibrazione SPAN ogni 24 ore In laboratorio si fa una calibrazione SPAN ad inizio e fine giornata La calibrazione a 5 punti va fatta con frequenza che dipende dalla procedura di analisi o dall’analizzatore (settimanale, mensile, annuale) e dopo che una calibrazione di SPAN abbia dato esito negativo non rimediabile

ESEMPIO Calcolo LOD e LOQ - Determinazione del limite di rivelabilità per la quantificazione del nitrito nelle acque mediante spettrofotometria VIS (metodo di Griess). Viene misurata l’assorbanza a 534 nm di 10 campioni indipendenti del bianco. I valori di assorbanza sono: A 1 = 0, 005; A 2 = 0, 004; A 3 = 0, 006; A 4 = 0, 011; A 5 = 0, 008; A 6 = 0, 007; A 7 = 0, 013; A 8 = 0, 012; A 9 = 0, 005; A 10 = 0, 007; Dai dati risulta: Da una retta di calibrazione ottenuta mediante regressione lineare dei minimi quadrati dei risultati dell’analisi di 11 soluzioni standard (intervallo di concentrazione: 7, 7. 10 -7 M – 5, 8. 10 -5 M) risulta una pendenza di 4, 79 x 104 L/mole e intercetta = 0

Esercizio per casa Dalla calibrazione di uno strumento con soluzioni standard contenenti Benzene (B) ed Esano (E) da 40 a 300 ppm si sono avute le risposte SB ed SE riportate in tabella CB e C E (ppm) 40 60 100 160 210 300 SB (m. A s) 0, 5 1 1, 9 2, 4 3, 1 5, 1 SE (m. A s) 0, 27 0, 6 0, 85 1, 15 1, 65 2, 6 Si deve analizzare un campione concentrazione incognita di Benzene cui si è aggiunto Esano a CE=120 ppm come standard interno. La risposta dello strumento di analisi è SB= 1, 2 m. A s e SE=0, 8 m. A s. Ricavare le rette di calibrazione e valutare la concentrazione di Benzene sia con il metodo dello standard interno che dello standard esterno. Discutere il risultato