Electroforesis SDSPAGE Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel

Electroforesis SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate. Poly. Acrylamide Gel Electrophoresis

APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS SDS-PAGE Monitoreo de pasos de purificación Western- blots Determinación de masa molecular. · Verificación de la concentración de proteínas. · Detección de proteólisis. · Identificación de proteínas inmunoprecipitadas. · Separación de proteínas marcadas con isótopos radioactivos.

ELECTROFORESIS: Método analítico. En un campo eléctrico las moléculas cargadas migran en la dirección del electrodo que tiene una carga opuesta.

Movilidad electroforética • Velocidad de migración: parámetro característico de una molécula cargada. Depende de la p. K de los grupos cargados y el tamaño de la molécula. • Influencias: tipo de buffer, concentración y p. H, la temperatura y el campo eléctrico ejercido, así como la naturaleza del material de soporte.

ELECTROFORESIS SDS-PAGE SDS : dodecil sulfato de sodio DETERGENTE ANIÓNICO En la electroforesis SDS-PAGE el SDS se agrega en TODO!!!! 1. En el gel 2. En el buffer de muestra 3. En el buffer de corrida

Electroforesis SDS-PAGE REACTIVOS UTILIZADOS Para hacer la matriz (el gel) Acrilamida Persulfato de amonio N, Nʼ-metilen-bis-acrilamida Tetrametilendiamino (TEMED)

¿Cómo se forma la matriz (el gel)?

MATRIZ DE POLIACRILAMIDA Fase líquida o un gel muy poroso Gel de poliacrilamida

Acrilamida • Químicamente inerte • Estable en un amplio rango de p. H, temperatura y fuerza iónica • Insoluble en agua • La matriz (el gel) se puede preparar de forma rápida y reproducible • Se puede variar la concentración de acrilamida y bisacrilamida para modificar de manera controlada el tamaño del poro: MAYOR RESOLUCIÓN

En esta técnica es posible modificar los porcentajes de acrilamida para obtener una mayor resolución % de Acrilamida Rango de separación (tamaño) 15% 12. 5% 10% 7. 5 % 5% 15 – 45 k. Da 15 – 60 k. Da 18 – 75 k. Da 30 – 120 k. Da 60 – 212 k. Da

ELECTROFORESIS SDS-PAGE GELES CONCENTRADOR Y SEPARADOR • Diferente p. H • Diferente % de Acrilamida GEL CONCENTRADOR Más poroso (2 -5% acrilamida) p. H 6. 8 Tris-HCl SDS GEL SEPARADOR Menos poroso (7 -15% acrilamida) p. H 8. 8 Tris-HCl SDS BUFFER DE CORRIDA Tris/Glicina/SDS

Se utilizan dos amortiguadores: El buffer de corrida y el buffer de muestra El Buffer de corrida contiene 1. SDS 2. Tris-HCl 3. Glicina

Se utilizan dos amortiguadores: El buffer de corrida y el buffer de muestra El Buffer de muestra contiene 1. Beta mercaptoetanol 2. Azul de bromofenol 3. Glicerol

¿Cómo se consigue el efecto concentrador?

Resolución de proteínas

¿Cómo vamos a visualizar las proteínas Marcadores de Peso Molecular preteñidos Frente de corrida

Los geles se pueden teñir con: Azul de Comassie Plata (nitrato de plata)

¿Cómo vamos a determinar el tamaño aproximado de las bandas obtenidas? Con los estándares de peso molecular: obtenemos el RF

¿Cómo vamos a determinar el tamaño aproximado de las bandas obtenidas? Distancia total Frente de corrida

Gel obtenido por SDS-PAGE que muestra el progreso de una purificación exitosa

Tipos de electroforesis de proteínas Nativa. No incluye SDS. Permite analizar proteínas con estructura terciaria y cuaternaria. 2 D. Doble separación Primera dimensión: Por su punto isoeléctrico Segunda dimensión: por su tamaño.