EFEITOS EM MACROMOLCULAS PROTENAS Estrutura dos 20 aminocidos

EFEITOS EM MACROMOLÉCULAS PROTEÍNAS

Estrutura dos 20 aminoácidos que compõe as proteínas

IMPORT NCIA DAS LIGAÇÕES QUÍMICAS FRACAS 1. Ligações covalentes não podem ser as responsáveis pelas interações entre moléculas na célula, pois, por definição, numa ligação covalente os átomos unidos devem pertencer a uma mesma molécula. 2. Ligações fracas ocorrem entre átomos de uma mesma molécula ou moléculas diferentes. 3. Uma ligação química é uma força atrativa que mantém átomos juntos. 4. Hb. A é mantida por ligações fracas.

5. Ligações fracas são facilmente quebradas. 6. Dois H mantidos por ligação covalente H 2 são separados por 0, 74 A enquanto que por Van der Waals 1, 2 A 7. O máximo de ligações covalentes no de valência (oxigênio tem 2 valências) 8. No caso de ligações fracas, o fator limitante é puramente espacial

9. O ângulo entre duas ligações covalentes é sempre o mesmo. Por exemplo: H H C H Todos tem 109 o H para ligações fracas o ângulo é variável 10. Quanto mais forte a ligação, maior a energia liberada por ela. A+B AB + energia

11. CALORIA Cal quantidade de energia necessária para elevar a temperatura de 1 grama de água de 14, 5 para 15, 5 o. C. Em geral, usa-se kcal/mol 1 kcal = 26 e. V 12. As ligações podem ser quebradas por calor, radiação, etc. AB + energia A+B 13. No equilíbrio temos: conc. AB Keq = conc. A x conc. B

14. Energia livre é a energia capaz de realizar o trabalho (G ) G ( G é negativo) reação espontânea no equilíbrio G = 0 15. Quanto mais forte a ligação, maior a mudança na “energia livre” que acompanha a sua formação, maior o no de átomos ligados.

16. G = - R. T. ln. Keq = e - G / RT R=1, 987 cal/o/mol T = temp. absoluta Keq = cte equilíbrio Temperatura = 25 o. C (298 K) G para ligações covalentes (H, O, etc) é da ordem de -50 a -110 kcal/mol keq muito alta, portanto a concentração de átomos não ligados será muitopequena.

17. Ligações fracas têm energias que variam de 1 a 7 kcal/mol e são constantemente feitas e quebradas. 18. Moléculas polares facilitam a formação de ligações fracas. 0, 95 A H+ 2105 o O H+ Raio de Van der Waals p/ o oxigênio é 1, 4 A Raio de Van der Waals p/ o hidrogênio é 1, 2 A

19. Tipos de LIGAÇÕES QUÍMICAS FRACAS a) Forças de Van der Waals b) Pontes de hidrogênio c) Ligações iônicas d) Ligações hidrofóbicas

20. Van der Waals Força atrativa que se origina pela aproximação de dois átomos ou moléculas. Energia 1 kcal/mol A

21. Pontes de hidrogênio Energia varia entre 3 a 7 kcal/mol. Aparece um hidrogênio ligado covalentemente com alguma carga positiva e um aceptor ligado covalentemente, porém carregado negativamente.

10 A 5 A fraca forte 4 A atração e repulsão balanceadas A soma de vários átomos ou moléculas pode chegar a 10 kcal/mol.

H R C C=O H N C Entre grupos peptídicos H R H C=O H H O C H Entre grupos OH

O H O- C=O Entre COO- e OH da Tyr H N+ H H O- C=O Entre NH 3+ e COO-

H N C O H O=C H C Entre OH da Serina e um grupo peptídico H R Ponte de Hidrogênio são mais fortes quando apontam diretamente para o aceptor H O H mais forte O O O H H mais fraca

22. Ligações iônicas Têm energia média de 5 kcal/mol Ocorrem entre moléculas que têm uma ou mais unidades de carga positiva ou negativa líquida. Ex: COO- e NH 3+ 23. Ligações fracas necessitam de superfícies complementares (chave - fechadura). 24. Moléculas de H 2 O formam pontes de hidrogênio. Moléculas orgânicas que formam pontes de hidrogênio são solúveis em água.

25. Moléculas não polares como o Benzeno, em água tendem a se unir ligações hidrofóbicas (tendência da água a excluir grupos não polares) 26. Ligações fracas participam das ligações E - S, dão flexibilidade e a forma das moléculas. 27. Algumas moléculas formam hélices e subunidades. Ferritin tem PM 480. 000, porém não contém uma única cadeia de 4. 000 a. a. , mas 20 polipeptídeos idênticos de cerca de 200 a. a. 28. Subunidades são econômicas e diminuem o erro de síntese

Formação de estrutura secundária das proteínas

Formação de estrutura terciária das proteínas Exemplo: hemoglobina humana

Formação de estrutura quaternária das proteínas Exemplo: hemoglobina humana Deoxihemoblobina Oxihemoglobina

Interação Enzima – Substrato Estrutura terciária da Hexokinase A

Formação de agregação de proteínas

Ação da radiação DIRETA INDIRETA

AÇÃO DIRETA 1. Absorção de Energia Excitação e Ionização 2. Processos de transferência de Energia ESR (Ressonância Eletro Spin) R S Termoluminescência Adição de 3 H

3. Formação de moléculas danificadas estáveis 4. Características da ação direta 4. a. Relação dose-efeito Teoria do alvo A = Ao. cm Beauragard (1985), Kempner (1986) temperatura dependente Swillens (1986) - considera “target” e a eficiência do “hit” processo multievento estocástico

“Teoria do alvo – target size” 1. Num organismo vivo temos um ou mais “target(s)”. 2. A interação da radiação com um organismo vivo é ao acaso 3. Um “hit” ou uma interação da radiação com o target mata, inativa ou induz um efeito radiobiológico no organismo 4. A probabilidade de produção de um hit é proporcional ao tamanho do target.

5. Para radiações de alta energia ocorre o que chamamos de ionizações primárias. 6. Uma ionização primária envolve 66 e. V de energia 1500 kcal/mol Ligação covalente 100 kcal/mol Ponte de hidrogênio 7 kcal/mol 7. Como as ionizações ocorrem ao acaso, a probabilidade de ocorrer 0, 1, 2, . . . , n ionizações é dada pela fórmula de Poisson P(n) = e-x (X)n n! Onde x é a função da exposição à radiação.

8. Como a energia é muito alta cada vez que ocorre 1 HIT INATIVAÇÃO BIOLÓGICA 9. A probabilidade de não ocorrer ionizações é P(0) = e –x A curva de sobrevivência ou atividade biológica medida após várias exposições decrescerá como uma simples exponencial A= A 0. e-KD A = Atividade após a dose D de irradiação A 0 = Atividade inicial

A exposição é dada em unidades de ionização primárias por cm 3 K é a constante característica de cada atividae biológica cuja uniadade é volume (cm 3 ) K é chamado RADIATION TARGET ou VOLUME SENSÍVEL Como as ionizações ocorrem ao acaso e a energia é alta: a sensibilidade é independente da FORMA e da COMPOSIÇÃO QUÍMICA do alvo

Para radiações não ionizantes, por exemplo UV, a energia absorvida depende de fatores tais como presença de ANÉIS AROMÁTICOS, PTES. DE ENXOFRE, etc. O target size K é obtido a partir da dose 37% ou D 37 que é a dose necessária para reduzir a atividade para 37% da inicial. A = 0, 37 A 0 = A 0. e-KD 37 ln 0, 37 = -1 = -KD 37 K=1 D 37

Cálculo do Peso Molecular Considerando: 1. RAD é a deposição de 100 ERGs de energia por cm 3 de material. 2. Densidade da proteína. 3. O número de Avogadro. 4. Uma série de dados obtidos por radiação. Chegou-se a uma equação empírica Peso molecular = 6, 4 x 1011 D 37 em RADs

1. Se tivermos mais de uma molécula, teremos soma de exponenciais 2. Só é válido para efeito direto da radiação (irradiação a seco) Exemplos da literatura Enzima Malato desidrogenase PM x 10 -3 74 Target size Radiação 73 e- Catalase Lisozima ATPase Glutamato desidrogenase 232 14 284 320 230 15 280 300 RX eee- Fosforilase de amido 215 210 g

Enzima Álcool Desidrogenase PM x 10 -3 141 No. de cadeias 4 PM x 10 -3 35 Target Radiação size 37 a Xantina Oxidase Glucose e Fosfatase 300 2 150 125 a 130 2 63 70 g Peroxidase 40 14 g a Amilase 96 2 48 46 g Fosfatase Alcalina 140 2 69 70 e-

Crotoxina 1. É a toxina mais potente do veneno de cascavel brasileira 2. PM por várias técnicas: 23. 000 3. Cristalizável 4. Contém duas subunidades CROTAPOTIN = PM 8 000 FOSFOLIPASE A 2 = PM 13 000 TOXICIDADE Crotoxina: LD 50 = 0, 05 mg/kg camundongo Fosfolipase A 2 : LD 50 = 0, 55 mg/kg camundongo Crotapotin: LD 50 100 mg/kg camundongo A interação das duas proteínas aumenta a toxicidade 10 vezes (não covalente)

Importância da fosfolipase A 2 R O=P H R = colina O H C 1 O C=O POLAR H O C 2 C H 2 3 O Fosfolipase A 2 C=O x x x x 1, 2 diacil fosfoglicerídeos APOLAR CH 3 - CH 2 - N+ - CH 3 Leticina

A dor é provocada pelo estímulo do receptor da dor, que é chamado nociceptor. PEI 2 e PGE 2 agem na membrana destes receptores alterando a atividade elétrica, produzindo estímulos de dor levados pelos nervos sensitivos ao sistema nervoso central. Bactérias Pirogênio exógeno Macrófagos Pirogênio endógeno Circulação C. N. C. PGE 2 Altera o centro regulador do hipotálamo Temp. 37 o. C do sangue como fria Ordena vaso constrição periférica Evita perda de calor. Ao mesmo tempo Tremores gera calor. Isto tudo leva à febre. Aspirina age no mesmo ponto.

Mecanismo de ação J. R. Vane (Nobel, 1982) Sérgio H. Ferreira - Med. Rib. Preto década de 70 Fosfolipídeos da membrana ASPIRINA Fosfolipase A 2 COOH Ácido aracdônico O Ciclo oxigenase COOH O O Endoperóxidos cíclicos O OH O Prostaciclina COOH HO OH Prostaglandinas clássicas PGE 2 PGI 2

RESULTADOS EXPERIMENTAIS 1. Irradiação de Fosfolipase A 2 e Crotoxina 1 mg/m. L Liofilizada - em placas de Petri, elétrons acelerados com doses de 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 Mrad. 2. Dissolução das amostras em solução fisiológica. 3. Determinação da atividade enzimática usando gema de ovo como substrato e glóbulos vermelhos de rato.

FOSFOLIPASE A 2 D 37 = 8 Mrad PM = 80 000 Agregação ? CROTOXINA Em gráfico semi log D 37 = 19 Mrad PM = 33 000

4. b. Fatores que afetam a radiosensibilidade das moléculas b. 1 Temperatura 77 K Ativ. Enz. 100 0 195 K 310 K 30 60 Dose Mrad Inativação da Ribonuclease por 60 Co (g) no vácuo

b. 2. Presença de O 2 Radioss. 3 2 1 0 720 Mm Hg Radiosensibilidade da Tripsina seca, irradiada com 60 Co D 37 oxigênio D 37 no vácuo

b. 3. Presença da segunda molécula Radiosensibilidade relativa de enzimas no estado sólido irradiadas na presença de diferentes aditivos D 37 nenhum / D 37 aditivo

b. 4. Conteúdo de água Dose 37 x 10 6 12 6 14 Arilesterase Colinesterase 28 % água

b. 5. Efeito do p. H Dose 37 x 10 6 10 2 3, 5 6, 5 8, 5 p. H Deoxiribonuclease dissolvida em tampão fosfato p. H 3, 5 - 8, 5, liofilizado e inativado com 60 Co

AÇÃO INDIRETA Reação entre as moléculas do soluto e as espécies reativas do solvente, formadas pela ação direta da radiação 1. Espécies reativas da água H 2 O H + OH + e-aq + H 2 O 2 + H 3 O+ Valores de G a p. H neutro

2. Algumas reações dos produtos da radiólise com o soluto 2. a. Abstração de átomos de H R H+H R H 2 2. b. Reações dissociativas R NH 3+ + e-aq R +NH 3 2. c. Reação de adição H H C=C + OH R R C OH C

2. d. Dimerização e adição Glicina NH 2 CH 2 COOH H e- aq NH 2 COOH CH 2 COOH NH 2 CH COOH CH 2 COOH Ácido aspártico

2. e. Reações de desprotonação CH 3 COH 2 CH 3 CH 2 OH 2 CH 3 CH OH álcool acetaldeído CH 3 CH 2 OH álcool 2. f. Hidrólise RCO NH CH R 2 RCO NH 2 + H 2 O OH RCO NH CH R 2 RCOR

1 0, 1 G 0, 01 0 5 X 10 -1 DNA ase G de inativação

1, 0 G 0, 5 0 0, 1 1, 0 10 100 Conc. DNA (%) G da formação de grupos monofosfatos (quebras simples da cadeia)

2. g. Adição de oxigênio R + O 2 RO 2 H 2. h. Transferência de H CH 2 OH + RSH CH 3 OH + RS

3. Fatores que afetam a radiosensibilidade das moléculas frente à radiação indireta 3. a. Concentração do soluto (‘efeito da diluição’) Geralmente o efeito da diluição está entre 0, 1 e 10% para macromoléculas e para moléculas pequenas, como a glicina, entre 10 -3 a 10 -1 M. Fração relativa 2 conc x conc dose 1 0 Conc. Carboxi Peptidase 1, 0

3. b. Presença do segundo soluto Tipo de reação competitiva (Scavengers) 3. c. Efeito do oxigênio Em algumas moléculas o O 2 pode aumentar o dano de 2 ou 3 vezes. Embora isto não seja observado em algumas enzimas e no DNA. 3. d. Efeito do p. H O p. H altera a distribuição de cargas na superfície molecular além da conformação molecular. 3. e. Efeito do tipo de radiação LET é menos efetivo em soluções diluídas

Mudanças na estrutura primária 1. Destruição de aminoácidos entre proteínas 2. Gly e Ala 3. Cys, His, Met, Phe, Tyr, Trp estão entre os mais radiosensíveis 4. Formação de grupos carbonilas a partir de quebras da ligação C - N 5. Formação de fragmentos de PM formação de agregados Por exemplo: crosslink s poli ala poli phe

Mudanças na estrutura secundária 1. Desestabilização das pontes de H 2. Agregação Por exemplo: % amino grupos de Lys ñ nativos 40 g globulina 30 BSA 20 10 10 1. Estrutura quaternária 2. Dissociação de subunidade 50 Dose x 10 -6 rad elétrons de Z Me. V

Ocorre, em seguida, uma reação em cadeia que pode ser interrompida de duas maneiras H OH + H 2 O 2 + H 2 OH H + H 2 O Que termina OH + H H 2 O ou OH + H 2 O 2 HO 2 + H HO 2 H 2 O 2 + H 2 O

Do ponto de vista de rendimento, quando a radiação atinge moléculas de água, temos: 28% de ionização 26% de excitação 47% de superexitação

H 2 O exitação H 2 O H + OH H 2 O + + e - ionização H+ + OH e- + H 2 O + H+ +H 2 O + H 2 OH e-aq H 2 O- H H + OH-

EFEITO DA RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA - UV

Efeito da radiação UV A) Absorção UV causa como efeio biológico excitação de parte das macromoléculas. O primeiro passo é a absorção de QUANTA - um processo que ocorre ao acaso QUANTA: São pulsos de energia que para uma dada frequência de luz que tem a mesma energia definida como E = h h = cte. de Plank = 6, 63 x 10 -34 J. seg 1 e. V = 1, 6 x 10 -19 Jaule

A absorção ocorre ao acaso e segue a equação: I/I 0 = e-nsl I = Intensidade transmitida I 0 = Intensidade incidente n = número de partículas absorventes/cm 3 l = comprimento do trajeto da amostra em cm s = cte. que depende da natureza das partículas e comprimento de onda da radiação

B) Rendimento quântico A probabilidade da UV provocar uma alteração mensurável é pequena porque a energia pode ser dissipada como fluorescência ou calor. Esta probabilidade é chamada rendimento quântico , que é o número de partículas danificadas pelo número QUANTA absorvido. é da ordem de 10 -2 ou menos para macromoléculas biológicas

C) Radiação Monocromática Usando-se prismas que filtram a luz UV, obtém-se bandas da ordem de 20 A com intensidade suficiente para produzir efeitos biológicos. D) Curva Dose-Efeito A inativação de enzimas obedece a equação: N/N 0 = e- D Onde: D = dose em QUANTA/cm 2 = é a sensitividade que varia com o comprimento de onda Se D = 1 N/N 0 = 1/2 = 37% Dose = 37%

CURVAS DE INATIVAÇÃO 100 10 10 1 % sobrevida A) Inativação de gramicidin (11 a a ) 2967 A 2650 A 1 2375 A 2650 A 2805 A 30 60 0, 01 QUANTA / cm 2 x 10 -21 2537 A 0, 02 0, 03 QUANTA / cm 2 x 10 -21 C) Inativação de DNA de haemophilus influenzae D) Inativação de Hema glutinina de vírus influenzae 100 10 % sobrevida 100 % sobrevida B) Inativação de Bacteriófago T 2 2967 A 1 2400 A 10 3023 A 1 2303 A 2652 A 2650 A 4 QUANTA / 8 cm 2 x 10 -21 10 QUANTA / cm 2 x 10 -21 20

AÇÃO EM PEOTEÍNAS E SEUS CONSTITUINTES Pode ocorrer - Rompimento de ponte C - Desaminação - Oxidação para formar carboxil ou ceto grupos - Transferência de amino grupos Phe, Tyr, Trp e cistina são os mais sensíveis. Deles, cistina é o mais sensível para produzir cisteína é 0, 2; para formar NH 3, H 2 S é 0, 04 e 0, 02 respectivamente para produzir NH 3 a partir de Phe, Tyr e Trp é 0, 002 para destruição de cistina é 0, 13; 10 vezes maior que para os aa aromáticos

INATIVAÇÃO DE ENZIMAS E A. A. Os QUANTA absorvidos pela cistina são os maiores responsáveis pela inativação por causa do rompimento das pontes S - S. 0, 03 L R I T 0, 02 D 0, 01 C CHT TD A CH P % 1/2 cistina I - insulina R - RNAase L - lisizima CH - quimiotripsina P - pepsina TD - triposfato desidrogenase A - aldolase D - DNAase C - catalase G - gramicidin CHT - quimiotripsinogênio

medido em água ou com proteína seca dá resultados semelhantes solvente parece não ser importante. RNAase dá mesmo para 95% etanol ou 100% H 2 O. Comprimento de onda é importante para algumas enzimas. p. H: não parece ser importante - lisozima tem mesmo a p. H 3 -12. T menor sensibilidade das proteínas O 2 não afeta Conc. da proteína não afeta