Dynamika buky Cytoskelet Bunn kontakty Motorov proteiny Aktivn

Dynamika buňky Cytoskelet Buněčné kontakty Motorové proteiny Aktivní pohyb

2. 1 Cykoskelet Dynamická struktura, vlákna + asociované proteiny Funkce: 1) Mechanická opora buňky, soudržnost buněk 2) Vnitrobuněčný transport 3) Vnitřní organizace, polarizace buňky, pohyb 4) Dělení buňky Typy cytoskeletu (eukaryota): 1) Aktinová filamenta (mikrofilamenta) 2) Intermediátní filamenta 3) Mikrotubuly

Dynamika cytoskeletu Cytoskeletární vlákno = polymer podjednotek Polymerace x odbourávání Orientace vláken: [+] a [-] konce Kritická koncentrace: kon x Cc = koff

Aktinová filamenta 5 -9 nm Dvouvláknová helikální struktura Podjednotky: Polymery aktinu Váže ATP/ADP Funkce: Kortex (vrstva pod membránou) Panožky, mikrovily (tvar a pohyb) Svalová kontrakce Transport Dělení buňky (kontraktilní prstenec)

Polymerace aktinu Polymerace: ATP-aktin - vazba - hydrolýza ATP ([+] konec) [+] konec roste rychleji než [-] Regulace polymerace: Profilin - ATP/ADP exchange factor, pomáhá polymeraci Thymosin - váže ATP-aktin, inhibice assembly VIDEO

Proteiny asociované s AF CAP - stabilizace [+] konce ARPs (actin related proteins) [-] konec, nukleace, větvení VIDEO Myosin - buněčný motor Svazky aktinových vláken

Mikrotubuly 25 nm Duté trubice - 13 protofilament Podjednotky: Dimery α a β tubulin, vazba GTP Funkce: Intracelulární transport Pohyb buněk (bičíky) Dělení buňky - rozchod chromozómů MTOC = microtubule organizing center Centrozóm (2 centrioly)

Polymerace tubulinu γ tubulin - nukleační centrum ([-] konec), prstenec, v MTOC αβ tubulin (dimer): růst vlákna

Dynamika mikrotubulů Dynamická nestabilita - GTP čepička (růst) x katastrofa VIDEO

Proteiny asociované s mikrotubuly Stathmin - vyvazuje podjednotky Catastrophin - destabilizace mikrotubulů Stabilizační MAP Capping proteins

Intermediátní filamenta 10 nm Polymery filamentárního proteinu Jaderné (lamin) x cytosolické Pouze metazoa (cytosolické) Funkce: Jaderný obal (asociace a rozpad) Opora buňky, tvar, buněčné spoje Více druhů cytoplazmatických IF (podle buněčného typu): Epitel - keratin Neuron - neurofilamenta Sval - desmin Různé mezenchymální buňky - vimentin Keratin

Polymerace intermediátních filament Menší dynamika Neváží ATP ani GTP Mechanická odolnost

2. 2 Buněčné kontakty Jak drží buňky pohromadě? Extracelulární matrix (ECM) Mezibuněčné spoje Pojivové tkáně - mechanický stres, vláknité polymery (kolagen) Epithel - ECM: basální lamina, mezibuněčné spoje Typy buněčných spojů: 1) Těsnící spoje 2) Kotvící spoje 3) Komunikační spoje

Těsný spoj (tight junction) Pásový spoj Umožňuje rozlišení různých částí membrány Brání difúzi látek mezi buňky (např. střevní epithel) Kotevní spoje Cell-cell: Cytoskelet-kotva-cytoskelet Adhezní spoje, desmozómy (cadheriny) Cell-ECM: Cytoskelet-kotevní protein-ECM Fokální adheze, hemidesmozómy (integriny)

Cell-cell kotevní spoje Adhezní spoj: pásový spoj např. epithely Aktinové svazky Cadheriny A-C-A-C. . . (transcelulární síť) Kontrakce - trubicové struktury Regulované kontakty Desmozóm: Intermediátní filamenta Plakový spoj Cadheriny Rozložení pnutí a tlaku

Cell-ECM kotevní spoje Fokální adheze: Aktinová filamenta Integriny Hemidesmozómy: Intermediátní filamenta Integriny Napojení na bazální laminu VIDEO

Komunikační spoje Gap junctions (mezerové spoje): Connexiny - kanály H. sapiens 14 typů connexinů Propustnost podle typu Elektrická synapse Synchronizace tkáně Plasmodesmata: Buněčné spoje u rostlin Včetně ER Transport látek Šíření virů

Epitheliální buňka - buněčné spoje

2. 3 Motorové proteiny Přeměna energie - konají práci Motorové proteiny asociované s cytoskeletem: 1) Intracelulární transport (váčky) 2) Buněčný pohyb (E. bičíky, brvy) 3) Svalová kontrakce 4) Dělení buňky (kontraktilní prstenec, rozchod chromozómů) Rotující motory: 1) Helikáza 2) ATP syntáza 3) Bakteriální bičík Energie: ATP (GTP), transport H+ přes membránu po gradientu Souvislosti: Buněčná reprodukce

Cytoskeletární motorové proteiny Cyklická vazba a hydrolýza ATP - konformační změny 2 způsoby pohybu: Kargo (náklad) - pohyb podél cytoskeletu Vůči buňce se pohybuje cytoskelet (bičík) Proteiny asociované s mikrotubuly: Kinesin - pohybuje se k [+] konci Dynein - pohybuje s k [-] konci Proteiny asociované s aktinovými vlákny: Myosinová rodina (např. myosin I, myosin II) VIDEO

Dynein a kinesin Kráčivý pohyb, druhý konec váže kargo Kinesin a příbuzné proteiny VIDEO

Myosinová rodina Asociace s aktinem Pohyb k [+] konci Myosin II: struktura VIDEO

Myosinová rodina Myosin - transport (např. m. RNA) (zde ash 1 m. RNA do pupene) Myosinová rodina: hlava - konzervovaná sekv. Svalová kontrakce

Rotující motory F ATPáza, helikáza (strukturní homology) Motor bakteriálního bičíku Helikáza: ds. DNA→ss. DNA (spotřeba ATP) Homohexamer - ale není šestičetná symetrie 3 místa - ATP, ADP + Pi, volné F ATPáza: transport protonů → syntéza ATP štěpení ATP → transport protonů VIDEO

F ATPáza = ATP synthetáza VIDEO NC 1997: Walker, Boyer A) Rotace Dva polokanály (z MMP, z matrix) 1. c podjednotka (Asp) - vazba H+ 2. Rotace 3. Uvolnění H+ Jednosměrná rotace (deprotonovaný Asp je hydrofilní) B) ATP synthéza Rotace - změna konformace Hexamer (3 x α 3 x β) 3 místa (cyklická změna): Open, Loose, Tight

Motorové proteiny - metody Rotace ATP syntázy VIDEO Pohyb značených aktinových vláken Důkaz chemiosmotické teorie Optická past (měří sílu myosinu) Pozorování indiv. molekul VIDEO

Mechanicky řízená syntéza ATP 1. Izolovaná ATP syntáza (F 1) - immobilizace (HIS tag) 2. Navázání magnetické kuličky 3. Rotace (elektromagnety) 4. Syntéza ATP (ADP+Pi) 5. Luciferáza (štěpení ATP, emise) 6. Detekce countů Itoh, H. et al. : Nature. 2004 Jan 29; 427(6973): 465 -8.

2. 4 Aktivní pohyb 1) 2) 3) 4) Svalová kontrakce (aktin + myosin) VIDEO Améboidní pohyb (aktin) Eukaryotické bičíky a brvy (tubulin + dynein) Bakteriální bičíky (protonový pohon, rotace) VIDEO

Svalová kontrakce Obratlovci: 1. Příčné pruhovaná svalovina 2. Hladká svalovina 3. Srdeční svalovina Sarkomera = jednotka svalu Actin/myosinová vlákna Regulace pomocí Ca 2+ Titin, tropomodulin, Z cap Troponin, tropomyosin

Svalový cyklus 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Nervový impuls (acetylcholin) Depolarizace buňky (vstup Na+) Otevření Ca 2+ kanálů (sakroplazmatické retikulum) Změna uspořádání komplexu (troponin/tropomyosin) Svalová kontrakce (ATP) Ca 2+ pumpa (ATP) Relaxace VIDEO

Améboidní pohyb Výběžky cytoplazmy: filipodia (1 D), lamellipodia (2 D), pseudopodia (3 D) Push and pull mechanismus: 1. Vypoulení membrány (assembly aktinu) 2. Fokální adheze 3. Změna tekutosti cytoplazmy (sol→gel), naplnění výběžku 4. Kontrakce zadní části (myosin) Listeria monocytogenes - intracelulární parazit, aktinové ocásky VIDEO

Eukaryotický bičík Prvoci, spermie, bičíkatá stadia řas Průřez bičíkem = tubulinová vlákna (9+2) Dynein: Pohyb po vlákně a zároveň vazba jiného vlákna Ohnutí (vlákna jsou ukotvena)

Bakteriální bičík Mechanizmus připomíná F-ATPázu (ATP syntázu) 1. Protonová pumpa (mezimembránový prostor) 2. Bičíkový motor (rotor + stator)

Shrnutí Cytoskelet = dynamická struktura: mechanická opora, buněčná soudržnost, transport, pohyb, reprodukce buňky Aktinová filamenta, intermediátní filamenta, mikrotubuly Molekulární motory: 1) Interagující s cytoskeletem (myosin, dynein, kinesin) Doprava karga, svalová kontrakce, eukaryotický bičík, améba 2) Rotační proteiny ATP syntáza, DNA helikáza, bakteriální bičík Pohyb: Svalová kontrakce Améboidní (panožky) Bičíky a brvy (eukaryota x bakterie)