DROSOPHILA TRANSGENICA 1 ENHANCER TRAP 2 SOVRAESPRESSIONE di

DROSOPHILA TRANSGENICA 1. “ENHANCER TRAP” 2. SOVRAESPRESSIONE di TRANSGENI 3. STUDIO DI PROMOTORI

TECNICA dell’ENHANCER TRAP Un enhancer trap contiene un promotore minimo, insufficiente di per sé, per indurre la trascrizione. Se, dopo la trasposizione si inserisce in una regione sotto l’influenza di un enhancer genomico, la sequenza inserita dovrebbe essere trascritta in maniera che riflette l’attività dell’enhancer. Tecnica utilizzata per: 1) Identificazione di nuovi geni 2) Analisi dell’espressione di geni tempo/tessuto specifici 3) Permette analisi molti geni simultaneamente

TECNICA dell’ENHANCER TRAP A) Enhancer TRAP P(Lac. Z) e B) Enhancer TRAP GAL 4 A) Enhancer TRAP P(Lac. Z): gene reporter codifica per la beta-galattosidasi L’attività dell’enhancer è localizzata tramite immunoistochimica o reazione con X-gal.

A) Enhancer TRAP P(Lac. Z)

1) LINEE “ENHANCER TRAP” a) Banche di drosophila con pattern espressione, collezione di oltre 4000 ceppi b) Con incroci specifici si possono studiare vari pattern di espressione

B) Enhancer TRAP GAL 4: sistema di Lievito. GAL 4 attiva trascrizione di geni a valle di UAS (Upstream Activating Sequence) Utilizzato per IDENTIFICARE NUOVI GENI e SOVRAESPRESSIONE di geni LIEVITO DROSOPHILA

2) Enhancer TRAP GAL 4 per identificazione di NUOVI GENI GAL 4 è prodotto SOLAMENTE se si inserisce sotto enhancer Gene reporter (Lac. Z/GFP) è espresso solo se GAL 4 lega la seq UAS

GAL 4/UAS SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO di TRANSGENI

GAL 4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto specifica

GAL 4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica Collezione di ceppi di Drosophila 1) 2) 3) Promotore UBIQUITARIO Promotore SPECIFICO (spazio) Promotore Temp-SENS (tempo) IL TRANSGENE (GENE X ) E’ ESPRESSO SOLAMENTE NEL TESSUTO SPECIFICO

GAL 4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica PROMOTORE Tessuto specifico ESISTONO MIGLIAIA di CEPPI di DROSOPHILA CHE ESPRIMONO GAL 4 IN DIFFERENTI TESSUTI E STADI DIFFERENTI DELLO SVILUPPO

GAL 4/UAS SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO di TRANSGENI SPAZIO TEMPO

GAL 4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica Tecnica molto utilizzata per studio di ONCOGENI • WT • MUTATO • DELETO • antisenso WT UAS/Cbl oncogene

Studio del PROMOTORE Drosophila puo’ essere un ottimo strumento per l’ANALISI del PROMOTORE: identificazione di regioni NECESSARIE per la funzione del Promotore Vengono prodotti MUTANTI di DELEZIONE fusi al gene Lac. Z Il geni ibrido viene fuso nell’elemento P e inserito nell’embrione L’attività della betagalattosidasi permette di identificare la regione MINIMA del PROMOTORE e sequenze NECESSARIE alla sua regolazione

Studio del PROMOTORE Analisi del PROMOTORE del gene DRONC: caspasi di Drosophila essenziale per apoptosi durante lo sviluppo embrionale del moscerino. Distinct promoter regions regulate spatial and temporal expression of the Drosophila caspase dronc T J Daish, D Cakouros and S Kumar

embrione cervello intestino ghiandole salivari

RNA interference Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans ANDREW FIRE*, SIQUN XU*, MARY K. MONTGOMERY*, STEVEN A. KOSTAS*†, SAMUEL E. DRIVER‡ & CRAIG C. MELLO‡ Fire at al, Nature V 391 pp 806 -811 (1998)

ds. RNAi is cut in 21 -23 nt fragments Zamore et al, Cell, v 101 pp 25 -33 (2000)

Ambion Inc. Austin, Texas, USA