Dra M L Ortiz Dep Microbiologa y Parasitologa

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Lunes Material general en el Laboratorio de Microbiología. 1. -Placas Petri con medio de cultivo sólido. 2. - Tubos de ensayo con medio de cultivo líquido. 3. - Tubos de ensayo con medio de cultivo sólido inclinado. 4. -Matraz para turbidimetria. 5. - Mechero Bunsen. 6. - Pipetas. 7. Microplacas. 8. - Asas de siembra. 9. - Asa de Digralsky. 10. - Micropipeta automática. 11. - Pipeteador manual. 12. - Puntas de pipeta automática. 13. - Placas Petri. 14. - Jarra de anaerobios. 15. - Placas de contacto Rodac. 16. - Lámina para análisis de superficies.

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Lunes L-1. - Preparación y esterilización de material y medios de cultivo. Los métodos de esterilización más utilizados son: - Flameado: Se emplea para esterilizar agujas, asas de siembra, pipetas, cuellos de tubos y matraces, etc. Consiste en someter directamente a la acción de la llama de un mechero los utensilios que se vayan a esterilizar. Asa y Aguja de siembra Esterilización del asa de siembra Diferentes tipos de Horno Pasteur Se esteriliza en horno Pasteur, a 180 o. C durante 2 horas. -Calor seco: Se usa para esterilizar material de vidrio debidamente preparado. Las placas Petri de vidrio se envuelven juntas en papel manila. Tubos de ensayo, probetas y matraces Erlenmeyer se taponan con algodón graso. Las pipetas se envuelven en papel manila después de colocar en la boquilla un trocito de algodón, que actúa como filtro impidiendo la contaminación del material absorbido con los microorganismos del operador y, a la vez, actúa como protector de éste, evitando la llegada del líquido a la boca.

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Lunes -Calor húmedo: Autoclave. Se emplea para la esterilización de medios de cultivo. Se pone agua en el fondo hasta cubrir las resistencias. Se introduce el material y se cierra la tapa apretando los tornillos. Se enciende el autoclave y se espera hasta que desprende un chorro de vapor, lo que indica que todo el aire que contenía el autoclave ha sido eliminado. Se cierra la espita y se sigue calentando hasta que el manómetro señale 1 atmósfera, manteniendo esta presión durante 20 minutos. Pasado este tiempo, se apaga y se deja descender la temperatura hasta que el manómetro marque cero. Se abre la espita y la no salida de vapor indica que la presión interna ha cesado. A continuación se abre el autoclave. - Filtración: Se emplea para esterilizar sustancias sensibles al calor Medio a esterilizar Embudo Pinza de sujección Filtro de celulosa Plataforma de vidrio Vacio Medio estéril

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Microscopio óptico: partes principales. A) Base. B) Fuente de iluminación. C) Diafragma. D) Brazo. E) Platina. F) Macro y Micrométrico. G) Condensador. H) Objetivos. I) Ocular Lunes

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Lunes L-3. - Observación de microorganismos. La observación de los microorganismos se raliza con el microscopio óptico. L-3. 1. - Observación en fresco 1. - Depositar una gota de agua en un porta y con el asa de siembra esteril tomar una muestra del tubo con el microorganismo. 2. - Mezclar las bacterias con el agua sin extender la muestra. Colocar un cubreobjetos encima de la suspensión bacteriana y observar al microscopio, anotando la forma de la bacteria y si presenta movilidad L. 3. 2. - Observación con tinciones - Tinción simple: se emplea un solo colorante. - Tinción diferencial: se emplea más de un colorante y se ve el comportamiento de las bacterias frente a ellos. - Tinción negativa: Lo que se colorea es el medio que rodea a la bacteria permaneciendo ésta sin teñir.

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Lunes L-3. 2. 1. - Tinción simple de azul de metileno. Frotis y fijación 1. - Poner una gota de agua en un porta 2. - Tomar la muestra con el asa de siembra 3. -Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero Tinción 1. - Cubrir la preparación con Azul de Metileno 5’ 2. - Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio Micrococcus luteus

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Lunes L-3. 2. 2. - Tinción negativa. 1. - Colocar una gota de Nigrosina en un porta 2. - Tomar muestra del microorganismo con el asa, flamear el tubo y tapar 3. - Mezclar con la Nigrosina y extender por todo el porta. Secar al aire y observar

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Lunes Tinción L-3. 2. 3. - Tinción de Gram Frotis y fijación 1. - Poner una gota de 2. - Tomar la muestra con agua en un porta el asa de siembra 3. - Decolorar con Alcohol 96º hasta que no suelte colorante 3. - Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero 4. - Lavar con agua 1. - Cubrir la preparación con Cristal Violeta 2’ 5. - Teñir con Safranina 1’ 2. - Añadir Lugol (mordiente) durante 1’ 6. - Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Lunes L-3. 2. - Tinción de Gram Cocos Gram - Bacilos Gram -

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Lunes L-3. 2. - Tinción de Gram Cocos Gram + Bacilos Gram +

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología X-3. 1. - Tinción de esporas. Tinción Frotis y fijación 1. -Poner una gota de agua en un porta 2. -Calentar, con un hisopo de algodón empapado en alcohol y prendido con la llama del mechero, hasta la emisión de vapores. Mantener caliente durante 5 minutos. 2. -Tomar la muestra de un cultivo de Bacillus 3. -Lavar con agua Esporas Bacterias Miercoles 3. -Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero 4. -Teñir con Safranina 1’ 1. -Cubrir la preparación con Verde Malaquita 5. -Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio

Miercoles Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología X-3. 2. - Tinción de ácido-alcohol-resistente. Tinción Frotis y fijación 1. -Poner una gota de agua en un porta 2. - Tomar la muestra de un cultivo de Mycobacterium 3. -Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero 1. -Cubrir la preparación con Fuchina fenicada 2. -Calentar con un hisopo de algodón empapado en alcohol y prendido con la llama del mechero hasta la emisión de vapores. Mantener durante 5 minutos. 3. -Lavar con agua y decolorar con alcohol ácido 5. -Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio 4. -Teñir con Azul de Metileno 1’

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Martes M. 4. 1. - Tinción de corpúsculos metacromáticos: El género Lactobacillus, forma gránulos con características tintoriales diferentes a las del resto del citoplasma que se denominan corpúsculos metacromáticos. 1. - Hacer un frotis con Yogurt 2. - Cubrir la preparación con Azul de Metileno 5’ Corpúsculos metacromáticos 3. - Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología L. 2. - Resiembra de bacterias en tubo de agar inclinado 1. - Esterilizar el asa de siembra a la llama del mechero 3. - Tomar muestra del microorganismo con el asa, flamear el tubo y tapar 4. - Tomar el tubo con medio estéril, destapar y flamear la boca 6. - Esterilizar el asa de siembra a la llama del mechero 2. - Destapar el tubo con microorganismo y flamear la boca, sin soltar el tapón 5. - Introducir el asa con el microorganismo hasta el fondo y deslizar en zig -zag 7. - Flamear la boca del tubo y tapar Lunes

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología M-1. - Aislamiento de microorganismos en placa. Martes

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Lunes L. 4. - Análisis microbiológico de aguas. L. 4. 1. - Recuento enterobacterias Lac+ (Coliformes totales) 10 ml Caldo Mac Conkey doble concentración 9 ml Caldo Mac Conkey Incubar 37ºC 24 horas 9, 9 ml Caldo Mac Conkey

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Martes NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) Número de tubos que dan la reacción positiva 3 tubos 10 ml 3 tubos 1 ml 3 tubos 0, 1 ml NMP/100 ml

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Martes M. 2. - Análisis microbiológico de aguas. M. 2. 1. - Recuento enterobacterias Lac+ (Coliformes totales) Recuento N. M. P. M. 2. 2. - Colimetria confirmativa Incubar a 37ºC 24 h M. 2. 3. - Coliformes fecales Medio VRBA Incubar a 44ºC 24 h Medio Mac Conkey Medio Levine

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Miercoles X. 1. - Análisis microbiológico de agua X. 1. 1. - Colimetria confirmativa Medio VRBA Se consideran coliformes las colonias rojas con un halo de precipitación mas oscuro alrededor X. 1. 2. - Coliformes fecales Producción de ácido y gas en el tubo con medio Mac Conkey Medio Levine: colonias de E. coli con la típica coloración verde metálico X. 1. 3. - Identificación de coliformes Seleccionar una colonia e inocular tubos para las pruebas del IMVi. C I: Producción de Indol (Tubo AP) Vi: Voges Proskauer: Producción de acetil metil carbinol (Tubo CL) M: Rojo de Metilo (Tubo CG) C: Utilización de Citrato (Tubo C)

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Jueves J. 1. - Análisis microbiológico de agua. I: Indol: Técnica: Inocular el problema en un tubo con Agua Peptonada (AP) e incubar a 37ºC durante 24 horas. Resultado: Añadir 2 gotas de Xilol (Indol I), agitar el tubo y dejar reposar. Añadir 1 gota de reactivo de Erlich (Indol II), resbalando por las paredes del tubo. La reacción es positiva cuando aparece un anillo rojo en la capa de xilol. La prueba es negativa si aparece el color amarillento del reactivo. M: Prueba del Rojo de metilo Técnica: Inocular el problema en tubos con medio Caldo glucosado (CG) introduciendo el asa de siembra y agitando un poco el medio líquido. Incubar a 37ºC durante 24 horas. Indol + Indol - Vi: Prueba de Voges-Proskauer. Producción de acetil-metil-carbinol: Técnica: Inocular el problema en tubos con medio Clark y Lubs (CL), introduciendo el asa de siembra y agitando un poco el medio líquido. Incubar a 37ºC durante 24 horas. Resultado: Añadir 2 gotas de "-naftol (VP I)y 2 gotas de KOH al 40% (VP II) y agitar. La prueba es positiva si aparece una coloración rosa salmón. La prueba es negativa cuando la coloración es amarillenta. Resultado: Añadir 2 gotas de Rojo de Metilo y agitar. La prueba es positiva si aparece una coloración roja. La prueba es negativa cuando la coloración es amarillenta. RM + RM - C: Citrato. Técnica: Con el asa de siembra se toma muestra del problema y se inocula un tubo C por picadura y en estría en la superficie. Incubar a 37ºC durante 24 horas. VP + VP - Resultado: Si el microorganismo ha utilizado el citrato, se produce en la superfície del medio una coloración azul. Si no se observa cambio de color en el medio se considera la prueba negativa. Citrato + Citrato -

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Viernes V-1. - Análisis microbiológico de aguas. V-1. 1. Resultados de las pruebas IMVi. C I: Producción de Indol (Tubo AP) M: Rojo de Metilo (Tubo CG) Vi: Voges Proskauer: Producción de acetil metil carbinol (Tubo CL) I: Añadir unas gotas de xilol (Indol I), agitar y dejar reposar. Añadir unas gotas de reactivo de Erlich (Indol II). M: Añadir unas gotas del indicador Rojo de Metilo Vi: Añadir unas gotas de α-naftol (VP I) y unas gotas de KOH al 40% (VP II) y agitar. C: Ver color del tubo. C: Utilización de Citrato (Tubo C) Medio Agua Peptonada (AP) Indol + Indol - Medio Caldo Glucosado (CG) RM + RM - Medio Clark y Lubs (CL) VP + VP - Medio Citrato (C) Citrato + Citrato -

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Agar Sangre Extracto de corazón y peptonas 20 g Na. Cl 5 g Agar 15 g Agua destilada 1000 ml Añadir 50 -80 ml de sangre de cordero Es un medio de cultivo general que permite el crecimiento de gran número de microorganismos. Se emplea para determinar las reacciones de hemólisis α-hemólisis: lisis parcial de los glóbulos rojos, se forma un halo verdoso alrededor de la colonia. β-hemólisis: lisis completa de los glóbulos rojos, aparece una zona transparente alrededor de la colonia. γ-hemólisis: no actúan sobre los glóbulos rojos, no forman ningún halo.

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Martes L-3. - Aislamiento y recuento de microorganismos mesofilos del suelo. Diluciones decimales 1 gr tierra 1 ml N= C. D-1. i-1 N= nº de unidades formadoras de colonias. C= nº de colonias por placa. D= nº de dilución (10 -3, 10 -4 ó 10 -5). i= inóculo (0, 2 ml). 1 ml 9 ml 9 ml 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 0, 2 ml Incubar a 28ºC en posición invertida, durante 4 días. Contar placas con 300 -30 colonias

Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología Miercoles V-3. 2. - Observación de las colonias de microorganismos viables. V-3. 3. - Observación microscópica de los hongos y actinomicetos. Penicillium sp. Aspergillus sp. Alternaria alternata. Streptomyces sp. Scharomyces cerevisiae.

Jueves Dra. M. L. Ortiz. Dep. Microbiología y Parasitología J. 2. - Aislamiento de microorganismos mesófilos del suelo. J. 2. 1. - Determinación de U. F. C. N= C. D-1. i-1 J. 2. 2. -Observación de las colonias de microorganismos viables. N= nº de unidades formadoras de colonias. C= nº de colonias por placa. D= nº de dilución (10 -3, 10 -4 ó 10 -5). i= inóculo (0, 2 ml). J. 2. 3. Observación microscópica hongos y actinomicetos presentes en el suelo. Penicillium sp. Aspergillus sp. Streptomyces sp.