Dottorato in Biochimica e Patologia dellAzione dei Farmaci

Dottorato in Biochimica e Patologia dell’Azione dei Farmaci Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e Biomediche IX ciclo Studio del ruolo funzionale e caratterizzazione strutturale del cuprocomplesso TFF 1 -Cu Tutor: Prof. Liberato Marzullo 26/01/2012 Dottorando: Sandro Montefusco

Introduzione: Famiglia dei Trefoil Factors Costituita da: peptide gastrico p. S 2/TFF 1, peptide spasmolitico SP/TFF 2 e fattore intestinale ITF/TFF 3 Struttura - Motivo caratterizzato da tre anse e stabilizzato da tre ponti disolfuro Funzione - Ruolo essenziale nei processi di restituzione e rigenerazione epiteliale nel tratto GI Coinvolgimento in cruciali processi fisiopatologici: insorgenza e sviluppo neoplastico, proliferazione, differenziamento, migrazione cellulare, apoptosi -

Introduzione: Lacrimal Glands Hypothalamus – Hypophysis Siti di espressione: TFF 1: stomaco, duodeno, colon, pancreas, ghiandole di Brunner, vescica, ghiandole salivari e lacrimali, epitelio respiratorio, ghiandole mammarie, dotti biliari. TFF 2: stomaco, ghiandole di Brunner, epitelio del dotto pancreatico e biliare. TFF 3: epitelio intestinale, cellule goblet, ghiandole Brunner, utero, mammella, ipotalamo, ipofisi. Bladder

Introduzione: Infiammazione Variazioni dei livelli dei peptidi TFF sembrano essere coinvolte nei processi neoplastici Ulcere intestinali, soggetti affetti dal morbo di Crohn e infezioni da H. pylori presentano, nelle aree compromesse, elevati livelli di TFF 1 Tumor-suppressor TFF 1 ridotto in metaplasie intestinali e adenomi gastrici, TFF 1 completamente assente nel 40 -60% di carcinomi gastrici Topi tff 1 knockout sviluppano adenoma gastrico e carcinoma intramucosale Carcinoma della mammella TFF 1 indotto da estrogeni TFF 1 marker tumorale

Trefoil Factor 1 Real Time tff 1 L’analisi effettuata su intestino di ratti, resi nutrizionalmente carenti di rame, ha mostrato aumento dell’espressione del peptide TFF 1 lega specificamente il rame. L’interazione induce un cambio di conformazione nella struttura terziaria della proteina.

Obiettivi: - Valutare l’espressione depletamento di rame. di TFF 1 in condizioni di - Studiare l’influenza del rame sull’attività biologica della proteina. - Analizzare il ruolo di TFF 1 nei meccanismi di omeostasi del rame. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF 1 -Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori.

Espressione di TFF 1 in cellule AGS Real Time PCR ** p value = 0, 08 * p value < 0, 05 L’espressione di TFF 1 aumenta in condizioni di depletamento di rame

Analisi del promotore: Saggi di Luciferasi

Analisi del promotore: Saggi di Luciferasi -435 controllo BCS anova p<0, 05 Nella regione -583/-435 esistono elementi sensibili alle variazioni di concentrazione del metallo che regolano positivamente l’espressione del gene in condizioni di deprivazione di rame

Analisi del promotore L’analisi della sequenza -583/-435 con il software Transfac ha mostrato la presenza di un sito putativo Sp 1 tra le sequenze consensus con score più elevato

Analisi del promotore sonda: p Sp 1: sequenza putativa di legame ad Sp 1 del promotore di tff 1 m Sp 1: sequenza mutata nella regione putativa di legame c Sp 1: sequenza di legame canonica ad Sp 1 Scr: sequenza scrambled sonda: c Sp 1

Analisi del promotore sonda: p Sp 1: sequenza putativa di legame ad Sp 1 del promotore di tff 1 m Sp 1: sequenza mutata nella regione putativa di legame c Sp 1: sequenza di legame canonica ad Sp 1 Scr: sequenza scrambled sonda: c Sp 1 Le proteine degli estratti nucleari legano in modo specifico la sequenza putativa di legame ad Sp 1

Obiettivi: - Valutare l’espressione depletamento di rame. di TFF 1 in condizioni di - Studiare l’influenza del rame sull’attività biologica della proteina. - Analizzare il ruolo di TFF 1 nei meccanismi di omeostasi del rame. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF 1 -Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori.

Rame e forma omodimerica di TFF 1 Western Blot: surnatanti di cellule AGS-AC 1 TFF 1 condizioni riducenti TFF 1 dimero condizioni non riducenti Il rame promuove la formazione dell’omodimero

Migrazione Cellulare: Wound Healing AGS-AC 1

Migrazione Cellulare: Wound Healing BCS 24 h + dox - dox * + dox - dox distance distanza ( m) (µm) AGS-AC 1 * p-value < 0, 05 TFF 1 * p-value < 0, 05 (Tosco A, Monti MC, Fontanella B, Montefusco S, D'Andrea L, Ziaco B, Baldantoni D, Rio MC, Marzullo L. , Cell Mol Life Sci. 2010) L’induzione di TFF 1 determina un aumento della migrazione cellulare La chelazione di Cu modula negativamente l’attività motogenica di TFF 1

Obiettivi: - Valutare l’espressione depletamento di rame. di TFF 1 in condizioni di - Studiare l’influenza del rame nella formazione dell’omodimero di TFF 1 e sulla sua attività motogenica. - Analizzare il ruolo di TFF 1 nei meccanismi di omeostasi del rame. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF 1 -Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori.

Rame e secrezione di TFF 1 in AGS-AC 1 Controllo Cu 10 M Cu 100 M r. T controllo FF 1 72 h Cu 10 μM Cu 100 μM In cellule incubate in eccesso di rame, si osserva un ritardo nella secrezione della proteina

TFF 1 e omeostasi del rame +/+ -/- Fegato KO tff 1 AGS-AC 1 Stomaco Intestino

TFF 1 e omeostasi del rame 24 h -S +/- dox 0 20 80 AGS-AC 1 Cu 10 M 300 Cellule iper-esprimenti TFF 1 accumulano quantità maggiori di rame

TFF 1 e omeostasi del rame 24 h -S Cu 10 M +/- dox 0 20 80 120 AGS-AC 1 BCS 500 M 300 Cellule iper-esprimenti TFF 1 trattengono il rame per tempi più lunghi 600

TFF 1 e omeostasi del rame Bassi livelli di rame Alti livelli di rame TFF 1 Cu 2+

Obiettivi: - Valutare l’espressione depletamento di rame. di TFF 1 in condizioni di - Studiare l’influenza del rame sull’attività biologica della proteina. - Analizzare il ruolo di TFF 1 nei meccanismi di omeostasi del rame. - Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF 1 -Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori.

Helicobacter pylori: interazione con TFF 1 H. pylori interagisce con TFF 1 Ipotesi per l’infezione tessuto- specifica caratteristica del batterio La porzione oligosaccaridica degli LPS di H. pylori legano TFF 1 nella forma dimerica Il p. H ottimale di questa interazione è tra 5. 0 - 6. 0

Helicobacter pylori: introduzione 1892 - Il medico italiano Giulio Bizzozero descrisse per la prima volta batteri spiraliformi nello stomaco di animali. 1893, Arch Mickrobiol Anat 1984 - Due ricercatori australiani, Marshall e Warren, descrissero per la prima volta una relazione tra strani bacilli ricurvi, dapprima classificati entro il genere Campylobacter, con forme di gastrite attiva e ulcere duodenali 1984, Lancet; 8390: 1311 -5 1989 - Classificazione del genere Helicobacter Goodwin et al 1989, int j syst bacteriol, 39: 397 2005 - I due ricercatori australiani ricevono il Nobel per la medicina

Helicobacter pylori: introduzione • Gram Negativo • Dimensioni: 0, 5 -1 m x 2 -4 m • Microaerofilo: 37°C 3 -5 giorni • Mobile per la presenza di 4 -6 flagelli • Genoma: 1, 4 - 1, 7 Mb • Patogeno per l’uomo • Ureasi positivo • Trasmissione: orale-orale / fecale-orale / gastro-orale • Epidemiologia: endemica paesi industrializzati paesi in via di sviluppo adulti bambini >50 anni 2 -10 anni 35 -40% 80 -90% 5 -10% 45 -50%

Helicobacter pylori: fattori di virulenza Cag island: locus ~ 40 kb, 31 geni. Cag Island Molti di questi geni codificano per il sistema di secrezione di tipo IV. Cag. A: proteina batterica che transloca nella cellula ospite promuovendo cambiamenti morfologici e alterazioni della membrana plasmatica. Suerbaum S. & Josenhans C. , Nature 2007 Effects of Vac. A: altera la permeabilità della membrana mitocondriale promuovendo l’apoptosi; stimola segnali pro-infiammatori; altera il normale traffico delle vescicole del compartimento endosomiale provocando la formazione di canale e formazioni di vacuoli. Bab. A 2: lega l’antigene Lewis(b) delle cellule epiteliali gastriche. Cover T. L. . & Blanke S. R. . , Nature 2005

Helicobacter pylori: LPS -Bassa immunogenicità degli LPS di H. pylori -Particolari variazioni nella componente “Lipide A” -Infezioni a lungo termine -Infiammazione cronica promuove un danno gastrico

Helicobacter pylori: LPS Lisati Cellulari Frazioni Subcellulari LPS

Helicobacter pylori: Influenza di TFF 1 nella colonizzazione Effetti dei trattamenti sulla vitalità di H. pylori Cu 10 µM BCS 500 µM Dox

Helicobacter pylori: Infezione di H. pylori in AGS-AC 1 rosso - H. pylori verde - TFF 1 blu - nuclei Controllo Cag. A + Dox 130 k. Da

Helicobacter pylori: Influenza di TFF 1 nella colonizzazione Infezioni con ceppo H. pylori P 12 wild-type Hp Cu Dox - Cu 10 M BCS � 500 M Hp + - + + + BCS Dox - + + + T-test : p-value **< 0, 01 * <0, 05 TFF 1 svolge un ruolo significativo nelle infezioni di H. pylori Il rame modula positivamente l’infezione di H. pylori mediata da TFF 1

Helicobacter pylori: Influenza di TFF 1 nella colonizzazione Il ceppo mutato P 12 HP∆1191 non Wt P 12 interagisce con TFF 1 P 12 HP 479 P 12 HP 1191 (Dolan B. et al. , dati confidenziali, in stampa) HP 479 codifica una D-glycero-D-manno-heptosyltrasferase HP 1191 codifica una LD heptosyltransferase

Helicobacter pylori: Influenza di TFF 1 nella colonizzazione Infezioni con ceppo mutato HP 479 Cu 10 M BCS � 500 M Cu Dox - + + + BCS Dox - + + + T-test : p-value **< 0, 01 * <0, 05

Helicobacter pylori: Influenza di TFF 1 nella colonizzazione Infezioni con ceppo mutato HP 1191 Cu control Dox - Dox + + Cu Dox +

Helicobacter pylori: interazione con TFF 1 HT 29 MTX E 12 (E 12): Subclone di cellule HT 29, colon carcinoma umano, caratteristiche per la formazione di uno strato mucoso. (Alemka A. , et al. , Infect Immun. 2010) TFF 1 e H. pylori colocalizzano nello strato mucoso (Dolan et al. , dati confidenziali, in stampa)

Helicobacter pylori: interazione con TFF 1 Infezioni in HT-29 E 12 con ceppo H. pylori P 12 wild-type Cu 10 M BCS � 500 M T-test : p-value * <0, 05

Rame e strato mucoso HT 29 MTX E 12 (E 12): Subclone di cellule HT 29, colon carcinoma umano, caratteristiche per la formazione di uno strato mucoso. (Alemka A. , et al. , Infect Immun. 2010)

Rame e strato mucoso controllo A B D E C F

Rame e strato mucoso controllo Cu

Risultati • Il rame influenza l’espressione della proteina. Nel promotore di tff 1 sono presenti elementi sensibili alle variazioni di concentrazione del metallo. • Il rame favorisce l’omodimerizzazione di TFF 1 e la sua attività motogenica. • TFF 1, nel modello cellulare AGS-AC 1, è coinvolto nei processi di assorbimento/secrezione del metallo. • TFF 1 favorisce l’infezione di H. pylori. Il rame modula positivamente l’infezione di H. pylori mediata da TFF 1.

Prospettive future • Verificare l’effettivo legame di Sp 1 sul promotore di TFF 1. • Approfondire il coinvolgimento di TFF 1 nei meccanismi di omeostasi del rame. • Individuare la regione di TFF 1 coinvolta nel legame con i LPS di H. pylori.

Ringraziamenti Università di Salerno Dipartimento Scienze Farmaceutiche e Biomediche Prof. Liberato Marzullo Prof. Alessandra Tosco Dr. Marguerite Clyne University College Dublin School of Medicine & Medical Science Dr. M. -C. Rio Dr. Bianca Fontanella Dr. Roberta Esposito Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology - CNRS. Strasbourg, France Dr. D. Baldantoni Dipartimento di Chimica - Università di Salerno Coordinatrice del Dottorato Prof. Antonella Leone Considero valore sapere in una stanza dov’è il nord, qual è il nome del vento che sta asciugando il bucato.