Doku Kltrlerinde Kullanlan Besin Ortamlar ve Kltr artlar

Doku Kültürlerinde Kullanılan Besin Ortamları ve Kültür Şartları Sebahattin ÖZCAN

Bitki Biyoteknolojisinin. Tarihçesi • • • • 1902 ilk izole edilmiş hücrelerin kültürü (Haberlandt) 1904 Olgun embriyoların kültürü (Hanning) 1917 Biyoteknoloji teriminin ilk defa kullanımı (Karl Ereky) 1920 Oksinin tanımlanması (Went ve ark. ) 1922 Kök ve sürgün uçlarının laboratuvarda çoğaltımı (Kotte ve Robbins) 1924 İlk embriyo kurtarma tekniği (mısır) (Dieterich) 1934 İlk sürekli kök kültürleri (domates) (White) 1934 İlk kallus kültürleri (Gautheret) 1942 İlk kallus kültürlerinden sekonder metabolit eldesi (Gautheret) 1946 Sürgün uçlarından (apikal meristem) ilk bitki eldesi (Ball) 1953 DNA'nın yapısının belirlenmesi (Watson ve Crick) 1954 Hücre süspansiyonlarından ilk bitki eldesi (Muir ve ark. ) 1957 İlk sitokininin tanımlanması ve organ oluşumunda sitokinin/oksin oranının öneminin ortaya konulması (Skoog ve Miller)

Bitki Biyoteknolojisinin. Tarihçesi • • • • 1958 İlk somatik embriyogenesis (havuç) (Steward ve ark. ) 1960 Enzimler kullanılarak ilk canlı protoplast izolasyonu (Cocking) 1962 MS besin ortamının geliştirilmesi (Murashige ve Skoog) 1965 Tek hücreden bitki rejenerasyonu (Vasil ve Hilderbrandt) 1967İlk haploid bitkinin üretimi (anter polen kültürü) (Bourgin ve Nitsch) 1968 B 5 ortamının geliştirilmesi (Gamborg ve ark. ) 1970 HEPA filtrelerin kullanılmaya başlanması 1971 Protoplastlardan ilk bitki rejenerasyonu (Nagata ve Takabe) 1978 Cinsler arası ilk somatik melezleme (Melchers ve ark. ) 1983 Transgenik ilk bitkinin elde edilmesi (tütün) (Murai ve ark. ) 1986 Transgenik ilk bitkinin tarla testleri (tütün) 1990 Sentetik tohum geliştirme ve hızlı dondurma yoluyla germplazm muhafazası çalışmalarının başlaması 1995 İlk rekombinant insan gıdası (Flavr Savr, domates)

BİTKİ BİYOTEKNOLOJİ 1. Bitki Doku ve Hücre Kültürleri 2. Bitki genetik Mühendisliği

Bitki doku ve hücre kültürlerinin bitki ıslahındaki uygulama alanları • Türler arası melezlemelerden sonra embriyo kültürü • Haploid bitki üretiminde anter (polen) ve yumurtalık (ovül) kültürü • Somaklonal varyasyon • İn vitro seleksiyon • İn vitro döllenme • İn vitro germplazm muhafazası • Somatik hücre melezlemesi (protoplast füzyonu) • Gen transferi

Bitki doku kültürünün ticari uygulamaları • Hastalıksız bitki elde edilmesinde meristem kültürü • Mikroçoğaltım • Sentetik tohum üretimi • Sekonder metabolit üretimi (kallushücre süspansiyonları)

Bitki Doku ve Hücre Kültürlerinin Tanımı • Tanımı: Yapay besin ortamında, Steril şartlarda (in vitro), yaprak gövde, anter, kök, çiçek, yan ve tepe meristemleri gibi bitki organları ile tek bitki hücre ve protoplastlarından yeni bitkilerin elde edilmesidir.

Yapay Besin Ortamı • Bitki doku ve organları büyüme için gerekli olan besin maddelerini içeren yapay besin ortamında gelişirler. • Doku kültürlerinin başarısını yapay besin ortamı önemli ölçüde etkilemektedir. • Dış şartlarda olduğu gibi sağlıklı in vitro bitki büyümesi için de; • nispeten yüksek miktarlarda (major elementler olarak isimlendirilen) azot (N), potasyum (K), kalsiyum (Ca), fosfor (P), mağnezyum (Mg) ve sülfür (S) • Düşük miktarlarda diğer elementler olan (minör bitki elementleri veya iz elementler) demir (Fe), nikel (Ni), klor (CI), manganez (Mn), çinko (Zn), bor (B), bakır (Cu), ve molibden (Mo) ihtiyaç duyarlar.

Yapay Besin Ortamı • Epstein (1971) e göre; bir element aşağıdaki durumlarda bitki gelişimi için mutlak gerekli olarak kabul edilir; • Onsuz bitki gelişme periyodunu tamamlıyamıyorsa, • Eğer aksiyonu sipesifik ve başka bir element tarafından yerine getirilemiyorsa, • Bitki üzerine direk bir etkisi varsa • Mutlak gerekli olduğu bilinen bir molekül yapısındaysa.

Yapay Besin Ortamı • Su • Major elementler: N, P, K, Ca, Mg, S • Minor (iz) elementler : , Mn, Zn, Cu, Na, Ni, CI, B, Mo • Vitaminler: thiamin, nikotinik asit, pridoksin, Myo -inositol, folik asit, glisin ve glutamin • Şekerler: sukroz, glikoz, maltoz, rafinoz ve fruktoz (20 -60 g/l) • Jel yapıcı maddeler: Agar (değişik tipleri), agaroz, phytagel ve Gelrite. Genellikle % 0. 251. 0 arasında kullanılırlar.

Yapay Besin Ortamı • Bitki büyüme düzenleyicileri • Bazı kimyasallar bitki dokuları içerisinde doğal olarak bulunurlar (endogenus) ve besin değerinden ziyade düzenleyici etkide bulunurlar. Bu bileşikler bitki hormonları veya bitki büyüme bileşikleri olarak bilinirler. • Bitki büyümesi için aynı fizyolojik etkiyi gösteren sentetik kimyasallar da Bitki Büyüme Düzenleyicileri olarak isimlendirilirler.

Bitki büyüme düzenleyicileri • Bitki Büyüme düzenleyicileri 5 grupta toplanmaktadır. 1. Oksinler 2. Sitokininler 3. Gibberellinler 4. Etilen 5. Absisik asit • • • Oksin ve sitokininler doku kültürlerinde gelişme için en önemli bileşiklerdir. Doğal olanlarla aynı veya yüksek etki yapan sentetik oksin ve sitokinler keşfedilmiştir. Doğal gibberellin ve absisik asite alternatif sentetik formları keşfedilmemiştir.

Oksinler • Oksinler in vitro besin ortamlarının vazgeçilmezidir. • Oksinler (sitokininlerlerle birlikte kullanılarak) kallus gelişimini, hücre süspansiyonunu ve organ gelişimini teşvik ederler. • Morfogenesizin yönünü belirlerler • Hücresel seviyede; oksinler hücre bölünmesi ve uzaması gibi temel işlemleri kontrol eder. • Hücre bölünmesini başlatma kapasitesine sahip oldukları için, belirli organ veya organize olmayan dokulara dönüşen meristemlerin oluşumunda rol alırlar. • Oksin biyosentezinin meristematik bölge, hızlı büyüyen yapraklar, kök uçları, koltuk altı meristemleri, ve gelişen çiçeklerde daha yoğun olduğu düşünülmektedir.

Oksinler • • Oksin çeşidi ve miktarını etkileyen nedenler; İhtiyaç duyulan gelişme ve büyüme Oksinin alım ve hedef dokuya ulaşma hızı Yapay besin ortamında ve eksplant içerisinde oksinin inaktivasyonu (oksidasyon veya konjugasyon ile). • Eksplantta oksinin doğal seviyesi ve sentezi • Bitki dokularının oksine hassasiyeti • Varsa, uygulanan oksin ile doğal endogenik (içsel) bileşikler arasındaki ilişki.

Oksinler: – – – • • İndol-3 - bütrik asit (IBA), indol-3 - asetik asit (IAA), naftalen asetik asit (NAA), 2, 4 -diklorofenoksi asetik asit (2, 4 -D), Picloram, Dicamba Genel olarak, Kök ve kallus gelişimini teşvik ederler Bitki büyüme düzenleyicileri genellikle besin ortamlarına 0. 1 -10 mg/l oranlarında ilave edilirler.

Sitokininler: • Sitokininler özellikle protein sentezini teşvik eder ve hücre döngüsünde rol alırlar. • Oksinlerle beraber hücre bölünmesi ve morfogenesizi (farklılaşmayı) teşvik ederler. • Besin ortamına ilave edildiğinde apikal dominansiyi kırarak koltuk altı meristemlerin gelişimini sağlar. En önemli sitokinler – Benzilamino pürin (BAP), – Zeatin, – Kinetin, – Thidiazuron (TDZ) • Genel anlamda Sürgün oluşumunu teşvik ederler.

Doku kültürlerinde oksin ve sitokinin birlikte kullanım etkisi OKSİN SİTOKİNİN Yüksek Düşük Çelik/sürgünlerde kök oluşumu Tek çeneklilerde (monokot) kallus oluşumu Embriyogenesizin ilk safhası Kallustan anventik kök oluşumu İki çeneklilerde (dikot) kallus başlangıcı Adventik sürgün/gövde oluşumu Sürgün kültürlerinde yan sürgünlerin çoğalması Düşük Yüksek

Gibberellinler • 100’den fazla gibberellin grubu (GA) hormon bilinmektedir. • GA 1 hücre uzaması için en etkili olanıdır. • Ticari olarak çok az gibberellin bulunmaktadır. • GA 3 (gibberellik asit) bitki doku kültürlerinde en fazla kullanıdır. Gibberellinler birçok gelişme safhasında rol alırlar – Buğdaygillerde gövde ve yaprak uzaması, – Tohum çimlenmesinin teşvik edilmesi, – Meyve gelişmesi – Tazeliğin korunması Doku kültürnde genel olarak hücre ve bitki uzamasını teşvik ederler

Absisik asit (ABA) • ABA yüksek oranlarda kullanıldığında genellikle kallus ve bitki gelişimini engellemektedir. • Ancak, düşük oranlarda kullanıldığında kallus ve bitki gelişimini teşvik etmektedir. • Özellikle normal embriyo gelişiminde ABA gerekli olmaktadır.

Etilen • Atmosferde bulunan çok düşük oranlardaki etilenin bitki gelişimi ve büyümesini etkilediği uzun süredir bilinmektedir. • Etilen tüm canlı bitki dokuları tarafından üretilmekte ve büyümeyi düzenlemektedir. • Temelde etilen gazı meyve olgunlaşmasında, yaşlanma ve yaprak dökülmesinde rol almaktadır. • Doku kültürü sırasında kültür kaplarında etilen gazı üretilmekte ve bitki gelişimini olumsuz etkileyebilmektedir.

Özgen vd.

After 2 months After 12 months After 8 months After 20 months Bulblet regeneration from immature embriyos of M. muscarimi on MS + 4 mg/l BA +0. 5 NAA Özcan Vd.

Kültür Ortamlarındaki Konsantrasyon (mg/l) Komponentler MS B 5 SH LS White S 3 NN Nitsch's H KM LM SI KNO 3 1900 2500 1900 80. 0 950 1900 - NH 4 NO 3 1650 - - 1650 - 720 600 1650 - NH 4 H 2 PO 4 - - 300 - - - - (NH 4)2 SO 4 - 134 - - - - Mg. SO 4. 7 H 2 O 370 250 400 370 720 185 300 1850 370 Ca. Cl 2. 2 H 2 O 440 150 200 440 - 220 166 600 22 440 Ca(NO 3)2. 4 H 2 O - - 300 - - - KCl - - 65 - - 300 - 1400 KH 2 PO 4 170 - - 170 68 68 68. 0 170 340 170 Na. H 2 PO 4. H 2 O - 150 - - - - Na. H 2 PO 4 - - 16. 5 - - - Na 2 SO 4 - - 200 - - - Mn. SO 4. H 2 O - 10 10 16. 89 - - - 10 21 - Mn. SO 4. 4 H 2 O 22. 3 - - - 7. 0 25 25. 0 - - 22. 3 KI 0. 83 0. 75 1. 0 0. 83 0. 75 - - 0. 75 4. 15 0. 83 H 3 BO 3 6. 2 3. 0 5. 0 6. 2 1. 5 10 10. 0 31 6. 2 Zn. SO 4. 7 H 2 O 8. 6 2. 0 10. 58 3. 0 10 10. 0 2. 0 43 8. 6 Cu. SO 4. 5 H 2 O 0. 025 0. 2 0. 025 - 0. 025 0. 50 0. 025 Na 2 Mo. O 4. 2 H 2 O 0. 25 0. 1 0. 25 - 0. 25 1. 25 0. 25 Co. Cl 2. 6 H 2 O 0. 025 0. 1 0. 025 - - - 0. 025 0. 125 0. 025 Fe. SO 4. 7 H 2 O 27. 8 15. 0 27. 85 - 27. 8 - - 27. 8 Fe 2(SO 4)3 - - 2. 5 - - - Sequestrene 330 Fe - - - - 28 - - Na 2 EDTA 37. 3 20. 0 - - 37. 3 Nikotinik asit 0. 5 1. 0 5. 0 - - 5 - - 0. 5 Pridoksin-HCl 0. 5 1. 0 0. 5 - - 0. 5 - 1. 0 0. 1 0. 5 Thiamin-HCl 0. 1 10. 0 5. 0 0. 4 - 0. 5 - 1 0. 1 Biotin - - - 0. 05 - 0. 01 - - Folik asit - - - 0. 5 - 0. 4 - - myo-inositol 100 1 000 - - 100 100 l-inositol - - - 100. 0 - - - Glisin 2. 0 - - 2. 0 - 0. 1 - 2. 0 Glutamin - - - - - 1462 Sakkaroz 30 000 20 000 30 000 - - 20 000 30 000 10 000

Sterilizasyon • Çalışma ortamının sterilizasyonu Steril kabin kullanımı • Besin ortamlarının sterilizasyonu için otoklavda 20 dakika boyunca 2 atm basınçta 121 o. C’de tutulması yeterli olmaktadır. • Alet ve ekipmanların sterilizasyonu 180 o. C’de 2 saat kuru hava fırınında

Sterilizasyon • Bitki materyallerinin yüzey sterilizasyonu 1. En fazla kullanılan yöntem ticari çamaşır suyu (sodyum hipoklorit-Na. OCl)’dur. örnek: Axion, Domestos. Ticari çamaşır suyu ve alkol kullanılırken bitki dokularına zarar vermeyecek, ancak bitki yüzeyinde bulunun bütün mikroorganizmaları öldürecek bir doz kullanılmalıdır. Yeşil bitki aksamının (yaprak, petiol ve kök gibi) yüzey sterilizasyonunda %20 -25’lik çamaşır suyu ile 15 -20 dakika Tohum yüzey sterilizasyonunda %75’lik çamaşır suyu 2530 dakika kullanılabilir. 2. Alkol (genellikle %75 oranında)

Kültür Şartları • Yapay besin Ortamının p. H değeri: 5. 6 -5. 8 • Nem • Işık : 15. 000 luks • Fotoperiyod: 16 saat aydınlık, 8 saat karanlık • Sıcaklık : Genellikle 22 -25 o. C

Doku Kültürlerinde Başarıyı Etkileyen Diğer Faktörler • Genotip ve totipotensi Totipontesi: Her bir canlı hücresinin yeni bir canlı oluşturabilecek yeteneğe (genetik şifreye) sahip olması durumu Totipotensi kabiliyeti genler tarafından kontrol edilmektedir. • Eksplantın alındığı ana bitkinin fizyolojik durumu • Eksplantın tipi