DNS amplifikci egy DNS szakasz sokszorostsa amplification pl

DNS amplifikáció (egy DNS szakasz sokszorosítása amplification) pl. DNS szekvenálásnál nagy jelentősége van - sejten belül (in vivo) pl. E. coliban - sejten kívül (in vitro) Készítette: N. P.

Sejten kívüli DNS sokszorosítás • használták az E. coli DNS polimerázát is • az áttörést azonban a hőstabil DNS polimeráz (Taq) hozta, ami a Thermus aquaticus -ból származik

PCR (polimeráz láncreakció) • A PCR egy automatizált DNS sokszorosító, amit az amerikai kutató Kary Mullis fejlesztett ki a 80 -as években • Ennek kifejlesztését a Taq polimeráz tette lehetővé, mivel megnövelte a PCR hatékonyságát

A PCR-hez szükségesek • • • hőstabil DNS polimeráz (Taq) templát DNS a cél szekvenciával d. ATP, d. CTP, d. GTP, d. TTP reverse és forward oligonukleotid primerek Mg 2+ ion a polimeráz enzim aktivitásához p. H stabilizáló puffer (Tris-Cl) és KCl

A PCR ciklikusan működik • 2. 3. Elődenaturáció 2 perc 95 °C A denaturáció során a dupla DNS szál ketté válik ez 95°C-on 30 -60 s-ig tart A primerek kötődnek a DNS szálakhoz 3’ irányba, ez kb. 55 -60°Con 30 -60 s-ig tart A szintézis során a polimeráz enzim 3’-5’ irányba kb. 2000 nukleotid/perc sebességgel dolgozik, 60 -120 s 72 -78°C-on Ezt a ciklust pl. 30 -szor megismétli az automatizált termosztát és millió számra felszaporítja a cél szekvenciánkat 72°C-on 10 perc lánchosszabbításért