DNR IR RNR MOLEKULIN STRUKTRA VADAS n Genetikos

DNR IR RNR MOLEKULINĖ STRUKTŪRA

ĮVADAS n Genetikos kursą pradėsime nuo molekulinės genetikos n n Pastarųjų metų mokslo pasiekimai, tobulinant tyrimo metodus ir kuriant naujas koncepcijas, labai išplėtė molekulinės genetikos žinias n n Molekulinė genetika tyrinėja DNR struktūrą ir funkcijas molekulių lygmenyje Šis progresas palietė ne tik molekulinę, tačiau ir požymių perdavimo bei populiacijų genetikas Didžiaja dalimi genetikos žinios yra sukauptos tiriant DNR ir RNR 2 -2

2. 1 DNR KAIP GENETINĖ MEDŽIAGA n Savo funkciją genetinė medžiaga atlieka tik tada, kai ji pasižymi tam tikromis savybėmis n n n 1. Informacija: Ji privalo turėti informaciją, būtiną visam organizmui sukurti 2. Paveldėjimu: Ji privalo būti perduodama iš tėvų vaikams 3. Replikacija: Ji turi būti kopijuojama n n Tada ji gali būti perduodama iš tėvų vaikams 4. Kintamumu: Ji privalo gebėti keistis n Toks kintamumas užtikrina plačiai stebima fenotpinę variaciją kiekvienos rūšies viduje 2 -3

2. 1 DNR KAIP GENETINĖ MEDŽIAGA n Daugelio genetikų, tarp jų ir Mendelio, duomenys atitiko šias keturias savybes n n Tačiau genetinės medžiagos cheminė prigimtis negalėjo būti nustatyta vien tik kryžminant organizmus Iš tikrųjų, DNR kaip genetinės medžiagos identifikavimas pareikalavo naujoviško požiūrio į eksperimentinę biologiją 2 -4

Fredericko Griffitho eksperimentai su Streptococcus pneumoniae n n Griffithas tyrė bakteriją (Diplococcus pneumoniae), kuri dabar vadinama Streptococcus pneumoniae Yra aptinkami du S. pneumoniae kamienai n S Smooth (lygus) n Sekretuoja polisacharidinę kapsulę n n n Ši apsaugo bakteriją nuo gyvūnų imuninės sistemos Auginamos ant kietos terpės suformuoja lygias kolonijas R Rough (šiurkštus) n n Nesugeba sekretuoti kapsulės Kolonijų kraštai nelygūs 2 -5

n n Be to, dviejų S kamienų kapsulės gali reikšmingai skirtis pagal savo cheminę sudėtį Retos mutacijos gali paversti S kamienus R kamienais ir atvirkščiai n Tačiau mutacjos nekeičia kamienų tipų 2 -6

n 1928 m. Griffithas atliko eksperimentus naudodamas du S. pneumoniae kamienus: IIIS tipo ir IIR tipo n 1. Pelėms suleistos gyvos IIIS tipo bakterijos n n n 2. Pelėms suleistos gyvos IIR tipo bakterijos n n n Pelės išgyveno Iš pelių kraujo nebuvo išskirta gyvų bakterijų 3. Pelėms suleistos aukšta temperatūra užmuštos IIIS tipo bakterijos n n n Pelės žuvo IIIS tipo bakterijos buvo išskirtos iš pelių kraujo Pelės išgyveno Iš pelių kraujo nebuvo išskirta gyvų bakterijų 4. Pelėms suleistos gyvos IIR tipo aukšta temperatūra užmuštos IIIS tipo bakterijos n n Pelės žuvo IIIS tipo bakterijos buvo išskirtos iš pelių kraujo 2 -7

2 -8

n Griffithas nusprendė, kad kažkokia medžiaga iš žuvusių IIIS tipo bakterijų transformavo IIR tipo bakterijas į IIIS tipą n n Medžiaga, kuri tai padarė, buvo pavadinta transformuojančiąja priežastimi n n Jis pavadino šį procesą transformacija Griffithui nepavyko nustatyti, kokia tai medžiaga Transformuojančiosios priežasties prigimtis buvo nustatyta gerokai vėliau, naudojant įvairius biocheminius metodus 2 -9

Avery, Mac. Leod ir Mc. Carty eksperimentai n n Avery, Mac. Leod ir Mc. Carty suprato, kad Griffitho tyrimų rezultatai gali būti panaudoti genetinei medžiagai nustatyti Jie atliko savo eksperimentus penktame XX a. dešimtmetyje n n Tuo metu jau buvo žinoma, kad pagrindiniai ląstelių makrokomponentai yra DNR, RNR, baltymai ir angliavandeniai Iš IIIS tipo bakterijų jie paruošė ląstelių ekstraktus, turinčius kiekvieną iš šių makromolekulių n Tiktai ekstraktai, turintys išgrynintą DNR, galėjo transformuoti IIR tipo bakterijas į IIIS tipo bakterijas 2 -10

n Avery et al taip pat atliko ir kitą eksperimentą n Jo reikėjo norint įrodyti, kad būtent DNR, o ne koks nors kitas ekstrakto komponentas (RNR ar baltymas) yra genetinė medžiaga 2 -11

Hershey ir Chase eksperimentai su bakteriofagu T 2 n n 1952 m. Alfred Hershey ir Marsha Chase pateikė papildomų įrodymų, kad genetinė medžiaga yra DNR Jie tyrė bakteriofagą T 2 n Jo sandara yra palyginti paprasta, nes jį sudaro tik dvi makromolekulės n Kapsidės viduje Padaryti iš baltymo DNR ir baltymai 2 -12

Bakteriofago T 2 gyvenimo ciklas 2 -13

n Hershey and Chase eksperimentų santrauka: n Naudojo radioizotopus, norėdami atskirti DNR nuo baltymų 32 P specifiškai pažymi DNR 35 S specifiškai pažymi baltymus Radioaktyviai pažymėtais fagais buvo užkrečiamos neradioaktyvios Escherichia coli ląstelės Po tam tikro laiko, reikalingo infekcijai įvykti, likusios fagų dalelės buvo pašalinamos n => Fagų liekanos ir E. coli ląstelės buvo atskiriamos Radioaktyvumas buvo vertinamas scintiliaciniu skaitikliu n n n 2 -14

Hipotezė n Tik fago genetinė medžiaga yra injekuojama į bakterijas n Radioaktyvi žymė turi parodyti, ar tai yra baltymas, ar DNR 2 -15

Rezultatai 2 -16

Duomenų interpretacija Dauguma radioaktyvios sieros rasta supernatante Tačiau tik maža dalis radioaktyvaus fosforo n Šie rezultatai rodo, kad infekcijos metu fago DNR buvo injekuota į bakterijų citoplazmą n Tai yra tas rezultatas, kurio buvo galima tikėtis, jei būtent DNR yra genetinė medžiaga 2 -17

Kai kuriuose virusuose genetinės medžiagos funkciją atlieka RNR n 1956 m. A. Gierer ir G. Schramm išskyrė RNR iš augalų viruso – tabako mozaikos viruso (TMV) n Išvalyta RNR sukeldavo tas pačias pažaidas, kaip ir intaktinis TMV n n Taigi, šių virusų genomą sudaro RNR Dabar aptikta nemažai RNR virusų 2 -18

DNR ir RNR virusų pavyzdžiai Virusas Šeimininkas Nukleino rūgštis Tabako mozaikos virusas Tabakas RNR Gripo virusas Žmogus RNR HIV (ŽIV) Žmogus RNR f 2 E. coli RNR Kalafiorų mozaikos virusas Kalafiorai DNR Herpes virusas Žmogus DNR SV 40 Primatai DNR Epstein-Barr virusas Žmogus DNR T 2 E. coli DNR 2 -19

2. 2 NUKLEINO RŪGŠČIŲ STRUKTŪRA n DNR ir RNR yra stambios makromolekulės, susidarančios iš keleto lygmenų struktūrų n n 1. Nukleotidai sudaro pasikartojančius vienetus 2. Nukleotidai susijungia sudarydami grandinę 3. Dvi grandinės sąveikauja sudarydamos dvigubą spiralę 4. Dviguba spiralė susisuka, susilanksto ir sąveikauja su baltymais, sudarydama 3 -D struktūras, formuojančias chromosomas 2 -20

2 -21

Nukleotidai n n Nukleotidai yra pasikartojantys DNR ir RNR struktūriniai vienetai Juos sudaro trys komponentai n n n Fosfatinė grupė Pentozė (cukrus) Azotinė bazė 2 -22

2 -23

n Šie atomai randami laisvuose nukleotiduose n Tačiau jie yra pašalinami, kai nukleotidai jungiasi tarpusavyje, sudarydami DNR ir RNR grandines A, G, C ar T Pasikartojantis dezoksiribonukleino rūgšties (DNR) elementas A, G, C ar U Pasikartojantis ribonukleino rūgšties (RNR) elementas Nukleotidų, randamų (a) DNR ir (b) RNR, struktūra 2 -24

n Bazė + cukrus nukleozidas n n Pavyzdžiai n Adeninas + ribozė = adenozinas n Adeninas + dezoksiribozė = dezoksiadenozinas Bazė + cukrus + fosfatas(i) nukleotidas n Pavyzdžiai n Adenozino monofosfatas (AMP) n Adenozino difosfatas (ADP) n Adenozino trifosfatas (ATP) 2 -25

Bazė visada prisijungia čia Fosfatai prisijungia čia 2 -26

n Nukleotidai kovalentiškai susijungia per fosfodiesterinę jungtį n n Tuo būdu grandinė turi kryptį n n Fosfatas jungia vieno nukleotido 5’ anglies atomą su kito nukleotido 3’ anglies atomu Iš 5’ į 3’ Fosforo rūgšties liekanos ir cukrūs sudaro nukleino rūgšties grandinės karkasą n Bazės kyšo iš karkaso 2 -27

2 -28

DNR struktūra buvo išaiškinta remiantis keliais esminiais rezultatais n n 1953 m. James Watson ir Francis Crick nustatė, kad DNR sudaro dviguba spiralė, kurioje nukleotidai sąveikauja tarpusavyje pagal tam tikras taisykles Tačiau šio atradimo mokslinius pagrindus sukūrė kiti mokslininkai n n n Linus Pauling Rosalind Franklin ir Maurice Wilkins Erwin Chargaff 2 -29

Linusas Paulingas n Penktajame XX a. dešimtmetyje jis nustatė, kad tam tikri baltymų regionai gali susilankstyti į antrinę struktūrą n n a-spiralė Šiai struktūrai išaiškinti, jis pagamino modeli, sudarytą iš rutuliukų ir lazdelių 2 -30

Rosalind Franklin n n Dirbo vienoje laboratorijoe su Mauricu Wilkinsu Naudojo Rentgeno spindulių difrakciją drėgnų DNR siūlų struktūrai tirti Difrakcinį vaizdą galima interpretuoti, naudojant matematinio modeliavimo metodus. Tai gali suteikti informacijos apie tiriamos molekulės struktūrą 2 -31

Rosalind Franklin n n Rentgeno difrakcijos metodais ji pasiekė gana didelės pažangos, tyrinėjant DNR struktūrą Difrakciniai vaizdai atspindėjo kai kurias pagrindines DNR savybes n n n Spiralinė struktūra Daugiau nei viena grandinė 10 bazių porų tenka vienai pilnai spiralės vijai 2 -32

Erwino Chargaffo eksperimentai n n n Chargaffas pirmasis panaudojo daugelį nukleino rūgščių išskyrimo iš gyvų ląstelių, išgryninimo ir matavimo biocheminių metodų Tuo metu jau buvo žinoma, kad DNR sudaro keturios bazės: A, G, C ir T Bazių sudėties analizė gali atskleisti svarbias DNR struktūros ypatybes 2 -33

2 -34

2 -35

Chargaffo tyrimų duomenys: bazių procentinis santykis skirtingų organizmų DNR Organizmas Bazių % Adeninas Timinas Guaninas Citozinas Escherichia coli 26. 0 23. 9 24. 9 25. 2 Streptococcus pneumoniae 29. 8 31. 6 20. 5 18. 0 Mielės 31. 7 32. 6 18. 3 17. 4 Vėžlių eritrocitai 28. 7 27. 9 22. 0 21. 3 Lašišų spermatozoidai 29. 7 29. 1 20. 8 20. 4 Viščiukų eritrocitai 28. 0 28. 4 22. 0 21. 6 Žmogaus kepenų ląstelės 30. 3 19. 5 19. 9 2 -36

Rezultatų interpretavimas n n Duomenys, pateikti lentelėje, sudaro tik nedidelę dalį visų rezultatų, gautų Chargaffo Iš rezultatų akivaizdžiai matyti, kad n n n Adenino procentas = timino procentui Citozino procentas = guanino procentui Šis dėsningumas vadinamas Chargaffo taisykle n Tai buvo vienas pagrindinių atspirties taškų, kuriuos panaudojo Watsonas ir Crickas DNR struktūrai išaiškinti 2 -37

Watsonas ir Crickas n Būdami susipažinę su visais šiais tyrimų rezultatais, Watsonas ir Crickas pasiryžo išsiaiškinti DNR struktūrą n n Jie bandė pagaminti DNR modelį iš rutuliukų ir lazdelių, kuriam būtų būdingi visi žinomi eksperimentiniai DNR bruožai Esminis klausimas buvo kaip dvi (ar daugiau) grandinių sąveikauja tarpusavyje n Pirminė idėja buvo, kad grandinės sąveikauja per fosfato. Mg++ sąsiuvas 2 -38

n Ši hipotezė, žinoma, buvo neteisinga! 2 -39

Watsonas ir Crickas n Tada jie sukūrė modelį, kuriame n n n Pradžioje jie manė, kad vandenilinės jungtys jungia identiškas bazes, esančias priešingose grandinėse n n Fosfodezoksiribozinis karkasas buvo išorėje Bazės buvo projektuojamos viena priešais kitą t. y. , A su A, T su T, C su C, and G su G Tačiau modeliavimas parodė, kad ir šis modelis nėra teisingas 2 -40

Watsonas ir Crickas n Tik tada jie suprato, kad vandenilinės jungtys susidaro tarp A ir T bei tarp C ir G n Taigi, jie pagamino modelį, kuriame A sąveikavo su T, o G – su C n Šis modelis jau atitiko visus tuo metu žinomus duomenis apie DNR struktūrą 2 -41

Watsonas ir Crickas Watsonas, Crickas ir Wilkinsas 1962 m. už DNR struktūros išaiškinimą gavo Nobelio premiją n Deja, Rosalind Franklin mirė 1958, o Nobelio premijos nėra skiriamos po mirties. n 2 -42

Dviguba DNR spiralė n Pagrindinės struktūros ypatybės n n n Dvi grandinės yra susivijusios apie centrinę ašį Vieną pilną apviją sudaro 10 bazių Abidvi grandinės yra antiparalelios n n Vienos kryptis yra nuo 5’ į 3’, o kitos - nuo 3’ į 5’ Spiralė yra dešninė n Kai ji vijasi nuo jūsų, spiralė sukasi pagal laikrodžio rodyklę 2 -43

Dviguba DNR spiralė n Pagrindinės struktūros ypatybės n DNR struktūra yra stabilizuojama n 1. Tarp komplementarių bazių susidaro vandenilinės jungtys n n n A jungiasi su T per dvi vandenilines jungtis C jungiasi su G per tris vandenilines jungtis 2. Bazių stekingas n DNR struktūroje bazės yra orientuotos taip, kad jų plokščiosios dalys “žiūri” viena į kitą. Esant tokiai orientacijai, tarp bazių susidaro stekingo jėgos, kurios papildomai stabilizuoja DNR struktūrą 2 -44

Pagrindinės savybės • Dvi DNR grandinės formuoja dešninę dvigubą spiralę • Bazės priešingose grandinėse jungiasi vandenilinėmis jungtimis pagal A/T ir G/C taisyklę • DNR grandinės yra antiparalelios pagal savo 5’ 3’ kryptį • Kiekvienos grandinės pilną 360° apviją sudaro 10 nukleotidų 2 -45

Dviguba DNR spiralė n Pagrindinės struktūros ypatybės n Spiralės paviršiuje susiformuoja du asimetriški grioveliai n 1. Didysis griovelis n 2. Mažasis griovelis n Kai kurie baltymai gali jungtis prie šių griovelių n Tuo būdu jie gali sąveikauti su tam tikromis nukleotidų sekomis 2 -46

2 -47

DNR gali susiformuoti į kelių tipų dvigubas spirales n DNR dviguba spiralė gali sudaryti skirtingos konformacijos antrines struktūras n n Dominuojanti forma, randama gyvose ląstelėse yra B-DNR Esant tan tikroms in vitro sąlygoms, gali formuotis A-DNR ir Z-DNR dvigubos spiralės 2 -48

n A-DNR n n n Dešninė spiralė Vienoje vijoje 11 bp Susiformuoja esant žemai drėgmei Nėra aiškių įrodymų apie jos biologinę svarbą Z-DNR n n n Kairinė spiralė Vienoje vijoje 12 bp Formavimą skatina n n n Esant didelei druskų koncentracijai - GC-turtingos sekos Esant mažai druskų koncentracija – citozino metilinimas Tokia konformacija gali būti svarbi transkripcijai ir rekombinacijai, bent jau mielių ląstelėse 2 -49

Bazės pakrypusios centrinės ašies atžvilgiu Bazės santykinai statmenos centrinei ašiai Fosfofdezoksiribozinis karkasas išsidėstęs zigzagiškai 9 -50

DNR gali sudaryti trigubą spiralę n XX a. Šeštojo dešimtmečio pabaigoje Alexander Rich et al atrado trigubą DNR n n Ji susiformavo in vitro naudojnant sintetinės DNR fragmentus Devintajame dešimtmetyje buvo nustatyta, kad natūrali dvigrandininė DNR gali jungtis su sintetine DNR grandine ir suformuoti trigubą DNR spiralę (tripleksą) n Sintetinė DNR grandinė jungiasi prie natūralios DNR didžiojo griovelio 2 -51

n T jungiasi prie AT poros natūralioje DNR n n C jungiasi prie GC poros natūralioje DNR Tripleksinė DNR gali dalyvauti keliuose svarbiuose procesuose n n Kaspino modelis Tripleksinės DNR formavimasis priklauso nuo specifinių sekų Bazių poravimosi taisyklės yra Replikacijoje, transkripcijoje, rekombinacijoje Neseniai aptikti ląstelių baltymai, specifiškai atpažįstantys tripleksinę DNR Bazių sekos pavyzdys 2 -52

Erdvinė DNR struktūra n Tam, kad DNR tilptų ląstelėjė, ji turi būti efektyviai kompaktizuota per erdvines struktūras n n Tokios struktūros sukuriamos dalyvaujant baltymams, galintiems jungtis prie DNR Plačiau apie tai bus kalbama sekančioje paskaitoje 2 -53

DNR apsiveja apie histoninius baltymus 2 -54

RNR struktūra n n n Pirminė RNR grandinės struktūra yra labai panaši į DNR grandinės struktūrą RNR grandinės paprastai būna nuo kelių šimtų iki kelių tūkstančių nukleotidų ilgio RNR sintetinama naudojant DNR kaip matricą. Šios sintezės metu naudojama tik viena iš dviejų DNR grandinių 2 -55

2 -56

n Nors RNR dažniausiai yra viengrandininė, RNE molekulėse gali formuotis dvigrandininiai regionai n Šios antrinės struktūros susidaro dėl komplementarių bazių poravimosi n n n Dėl to trumpuose RNR segmentuose susiformuoja dviguba spiralė Tipiška RNR dviguba spiralė n n n A su U ir C su G Yra dešninė Sudaro A formą, kurioje vienai vijai tenka 11 -12 bp Gali susidaryti skirtingų tipų RNR antrinės struktūros 2 -57

Komplementarūs regionai Palaikomi vandenilinių jungčių Išsikišusi kilpa Vidinė kilpa Išsišakojusi kilpa arba mazgas Kamieninė kilpa Nenkomplementarūs regionai Turi bazes, išsikišančias iš dvigrandininių regionų Taip pat vadinama smeigtuko galvute 2 -58

n Daugelis veiksnių gali įtakoti RNR tretinę struktūrą n Pavyzdžiui n n Molekulė turi viengrandininius ir dvigrandininius regionus Bazių poravimasis ir stekingas RNR molekulėje Jie sąveikauja sudarydami šias 3 -D struktūras Sąveikos su jonais, mažomis molekulėmis ir stambiais baltymais Kaspino modelis n Tretinė t. RNRphe struktūra n Tai transportinė RNR kuri perneša fenilalaniną 2 -59