Dnombrement ou numration manuelle des cellules sanguines Dilution

Dénombrement ou numération manuelle des cellules sanguines Dilution n Mise en hématimètre n Comptage n Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND – POCHET 1

Dilution n n Indispensable pour dénombrer un nombre raisonnable de cellules Adaptée au type cellulaire étudié pour n n Le taux de dilution Le diluant Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 2

Dilution par dispositif Unopette® Matériel : dispositif type Unopette disponible uniquement pour numération des plaquettes et leucocytes n n n Volume : 1980 µL Propriétés du liquide : • hypotonique hémolysant les hématies • contenant un antiagrégant plaquettaire Réservoir scellé contenant un volume précis et adapté de diluant Capillaire mesurant précisément le volume de sang Année 2008 Volume : 20 µL Permettant une dilution au 1/100 ième pour dénombrer les thrombocytes et éventuellement les leucocytes Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 3

1. 2. Dilution n Technique 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Année 2008 Percer l’orifice du réservoir à l’aide du capuchon rigide Homogénéiser le sang en agitant le tube Plonger le capillaire dans le sang et laisser monter le sang par capillarité Sortir le capillaire et essuyer l’extérieur Presser sur le réservoir pour créer une dépression Introduire le capillaire jusqu’à la garde Relâcher la pression ce qui aspire le sang Rincer le capillaire en pressant et relâchant modérément sur le réservoir Homogénéiser la suspension Retourner le capillaire en prenant garde aux aérosols Positionner le capuchon rigide. Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 4

Mise en hématimètre Nécessaire n n n Année 2008 pour dénombrer dans un volume connu le nombre de cellules présentes dans une certaine fraction de la suspension préparée. Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 5

Mise en hématimètre n Matériel n Hématimètre adapté propre et sec possédant n n deux plateaux parallèles deux rigoles un plancher où est gravé un quadrillage Lamelle épaisse planée optiquement collée sur les plateaux délimitant ainsi la profondeur De face Plateaux Rigoles Plancher Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET De profil 6

Hématimètre de Malassez Surface totale quadrillée de 5 mm 2 : (2, 5 x 2) mm n Constituée de 100 rectangles n n 25 quadrillés en 20 petits carrés 25 non quadrillés 25 possédant des lignes horizontales 25 avec des lignes verticales Profondeur de 0, 2 mm définie par la lamelle planée Soit Volume total : Volume d’un rectangle : Volume d’une bande de dix rectangles : Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 1 µL 1/100 µL 1/10 µL 7

Mise en hématimètre n Technique Placer l’hématimètre propre , sec et muni de sa lamelle sur une surface horizontale Homogénéiser la suspension cellulaire Éliminer les premières gouttes non homogènes Placer le capillaire au niveau du vide sous la lamelle Presser sur le réservoir pour introduire dans la cellule de comptage 1. 2. 3. 4. 5. n n Année 2008 en une seule fois, rapidement, sans bulles d’air, sans déborder dans les rigoles Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 8

Hématimètre de Malassez Numération des érythocytes (hématies) Dilution (D) : n 1/200 Volume (V) : n 4 rectangles quadrillés les plus éloignés possibles n soit 4/100 µL = 1/25 µL = 0, 04 µL Nombre d’hématies par litre de sang = Somme des nombres trouvés dans les 4 rectangles x 1/V x 1/D Somme des nombres trouvés dans les 4 rectangles x 25 x 10 6 x 200 Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 9

Numération des érythrocytes Dénombrement dans le volume Comptage Dénombrement en zone limite (1/2) 22 53 55 53 40 Total : 223 globules rouges dans ce rectangle puis 218, 215 et 219 dans les autres rectangles Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 10

Numération des érythrocytes Résultats Homogénéité entre zones comptées 5 % de la valeur moyenne (219) = 10 Écart toléré : 219 ± 10 soit de 209 à 229 Toutes les valeurs sont comprises dans cet intervalle : la numération est homogène et le nombre de 875 contenu dans un volume de 0, 04 µL de dilution au 1/200 peut être pris en compte. Si une nouvelle numération sur une autre mise en hématimètre validée comme homogène donne une valeur de 861 : Concordance des valeurs trouvées Les deux valeurs sont concordantes ; la moyenne peut être faite : (875 + 861)/2 = 868 Le résultat de la numération des hématies de ce sang est calculé : 868 x 25 x 106 x 200 = 4, 345. 1012 = 4, 34. 1012 /litre de sang pur Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 11

Numération des érythrocytes Interprétation Valeurs de référence 4 à 5 T(1012) /L sang 4, 5 à 5, 5 T(1012) /L sang n è Résultat inférieur aux valeurs de référence Érythropénie pouvant entraîner une anémie si le taux d’hémoglobine est également abaissé Année 2008 n è Résultat supérieur aux valeurs de référence Polyglobulie probable (à confirmer par un hématocrite et un dosage d’hémoglobine élevés) Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 12

Hématimètre de Malassez Numération des leucocytes Dilution (D) : n 1/20 Volume (V) : n Tout le volume n soit 1 µL Nombre de leucocytes par litre de sang = Nombre trouvé dans le quadrillage x 1/V x 1/D Nombre trouvé dans le quadrillage x 106 x 20 Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 13

Numération des leucocytes Comptage Dénombrement dans le volume total : les 100 rectangles Dénombrement en zone limite (1/2) : le pourtour du quadrillage * * * X 400 X 100 Ici : 22 globules blancs dans ces 4 rectangles (attention aux artéfacts*) Dans les 100 rectangles, le nombre trouvé est de 290 Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 14

Numération des leucocytes Résultats Concordance des valeurs trouvées Deux dénombrements sur deux mises en hématimètre différentes donnent les valeurs suivantes : 290 et 310 Elles sont concordantes ; la moyenne peut être faite : (292 + 310)/2 = 301 Le résultat de la numération des leucocytes de ce sang est calculé : 300 x 106 x 20 = 6, 02. 109 = 6. 109 /litre de sang pur Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 15

Numération des leucocytes Interprétation Valeurs de référence 4 à 10 G (109) /L sang n è Résultat inférieur aux valeurs de référence Leucopénie due à la baisse d’une variété leucocytaire (à recher par l’établissement de la formule leucocytaire) ou à une baisse globale Année 2008 n è Résultat supérieur aux valeurs de référence Hyperleucocytose due à l’augmentation d’une variété leucocytaire ou à une augmentation générale Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 16

Hématimètre de Malassez Numération des thrombocytes (plaquettes) Dilution (D) : n 20 µL / 2000 µL = 1/100 Volume (V) : n 2 bandes de dix rectangles n Soit 20 x 1/100 µL = 1/5 µL = 0, 2µL Nombre de thrombocytes par litre de sang = Somme du nombre trouvé dans les deux bandes x 1/V x 1/D Nombre trouvé dans les deux bandes x 5 x 106 x 100 Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 17

Numération des thrombocytes Comptage Dénombrement dans 20 rectangles (2 bandes de 10) Dénombrement en zone limite (1/2) : le pourtour des deux bandes X 400 Ici : 12 plaquettes dans ce champ Dans les 20 rectangles, le nombre trouvé est de 540 Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 18

Numération des thrombocytes Comptage Délicat à cause des propriétés des plaquettes : n Adhésives -> utiliser d’un anticoagulant et d’un liquide antiagrégant n Réfringentes -> éliminer tout source d’erreur (poussières et microbulles d’air) par nettoyage et séchage minutieux n Petites et légères -> réaliser une sédimentation longue (40 minutes pour l’hématimètre de Malassez) en chambre humide. Résultats obtenus lors de deux mises en hématimètre différentes : 540 et 562 Elles sont concordantes ; la moyenne peut être faite : (540 + 562)/2 = 551 Le résultat de la numération des thrombocytes de ce sang est calculé : 551 x 5 x 106 x 100 = 275. 109 /litre de sang pur Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 19

Numération des thrombocytes Interprétation Valeurs de référence 200 à 400 G (109) /L sang n è Résultat < 150 G/L Thrombopénie Année 2008 n è Résultat > 500 G/L Thrombocytose Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET 20