Dnombrement ou numration automatise des cellules sanguines n

Dénombrement ou numération automatisée des cellules sanguines n Principes par impédancemétrie n par diffraction de la lumière n par analyse en flux n n Résultats de l’hémogramme Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 1

Principe COULTER par impédancemétrie Le dispositif de mesure Voltmètre mesurant la tension U aux bornes du circuit Générateur de courant constant I Électrodes placées de chaque côté du micro orifice entre lesquelles existe une impédance Z - + Cuve contenant une solution saline conductrice du courant électrique aspirée par le micro orifice d’un tube de verre Z est constant U = Z. I = constant Le flux passant par le micro orifice ne contient que la solution d’électrolytes Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 2

Principe COULTER par impédancemétrie Les cellules sanguines sont mauvaises conductrices de l’électricité L’aspiration entraîne les cellules à passer les unes après les autres au travers du micro orifice - + Z donc U = Z. I Chaque cellule, mauvaise conductrice du courant électrique, passant par le micro orifice fait augmenter l’impédance entre les deux électrodes de mesure Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 3

Principe COULTER par impédancemétrie Les cellules sont comptées et mesurées après amplification du signal. Les impulsions peuvent être visualisés sur un oscilloscope : U en fonction du temps Il y a proportionnalité entre l’impulsion de tension et la taille de la cellule U Possibilité de choisir les populations selon leur taille avec des seuils au-delà ou en deçà desquels les cellules ne sont pas prises en compte Temps Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 4

Principe COULTER par impédancemétrie n Possibilité de classer les populations en fonction leur taille : Histogrammes de distribution (%(relatif) en fonction du volume) Discrimination entre hématies et thrombocytes, dénombrés dans la même dilution, basée sur leur volume respectif Double seuil % Plaquettes Phénomène de coïncidence* Globules rouges f. L * Passage du micro orifice par deux cellules à la fois, donnant une petite sous population de volume double, n’existant que sur de grandes populations et corrigé de façon statistique au niveau de la numération des globules rouges (mais visible sur l’histogramme de distribution) Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 5

Principe par diffraction lumineuse n Dispositif de mesure n n Mise en flux pour étude individuelle au niveau de la zone d’inspection Cellule de mesure où est focalisé un faisceau lumineux Flux d’échantillon Aucun signal mesuré Source lumineuse monochromatique Volume d’inspection vide Année 2008 Arrêt du faisceau lumineux Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 6

Principe par diffraction lumineuse Les cellules sanguines diffractent la lumière Détection d’un signal Comptage et mesure de la cellule Présence d’une cellule dans la zone d’inspection -> Diffraction de la lumière débordant l’écran et venant exciter une cellule photoélectrique Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 7

Autres mesures en flux n Possibilité de multiples mesures effectuées en même temps au niveau de la zone d’analyse du flux Mesure du flux lumineux diffracté à grand angle : Estimation de la granularité du cytoplasme Mesure du flux lumineux diffracté à petit angle : Estimation de la complexité de la forme du noyau Mesure du flux lumineux transmis : Dosage de l’hémoglobine sur suspension après lyse des hématies Estimation du volume du noyau des cellules nucléées Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 8

Autres mesures en flux n Possibilité de multiples mesures effectuées en même temps au niveau de la zone d’analyse du flux Mesure du courant de haute fréquence transmis Estimation de la densité du noyau Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 9

Autres mesures en flux n Possibilité de multiples mesures effectuées en même temps au niveau de la zone d’analyse du flux Cellules marquées par des marqueurs fluorescents spécifiques Filtre spécifique Mesure du flux lumineux passant le filtre avec dénombrement et identification des cellules portant le marqueur Présence d’ARN marqué : réticulocytes Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 10

Autres mesures en flux n Possibilité de multiples mesures effectuées en même temps au niveau de la zone d’analyse du flux Cellules marquées par des marqueurs fluorescents spécifiques Filtres spécifiques Mesure du flux lumineux passant le filtre : Dénombrement et identification des cellules portant le marqueur Présence d’anticorps spécifiques de cellules : par exemple T 4/T 8 Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 11

Exemples de résultats d’hémogramme n Bilan érythrocytaire Pop GR anormale (IDC > 15 %) Observation des hématies sur frottis coloré au MGG pour constater l’anisocytose ou autres anomalies de forme ET VGM GR Hb Ht VCM TCMH CCMH IDC 2, 7 12, 2 35 128 45 34, 5 18 Année 2008 Numération des globules rouges en 1012/L Dosage de l’hémoglobine en g/d. L Hématocrite en % Volume Cellulaire Moyen ou VGM en f. L Teneur Cellulaire Moyenne en Hémoglobine en pg Concentration Cellulaire Moyenne en Hémoglobine en g/d. L de GR Indice de Distribution Cellulaire appelé aussi RDW ou IDR = coefficient d'anisocytose < 15 % = valeur statistique correspondant ETx 100/VGM Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 12

Exemples de résultats d’hémogramme n Bilan thrombocytaire Deux histogrammes l’un représentant les valeurs mesurées l’autre les valeurs extrapolées Population plaquettaire anormale (courbes dissociées) VPM Plt VPM 35 9 Numération des plaquettes en 109/L Volume Plaquettaire Moyen en f. L Observation de l’aspect des plaquettes sur frottis coloré au MGG pour constater la présence d’un nombre de plaquettes diminué et une hétérogénéité de taille Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 13

Exemples de résultats d’hémogramme n Bilan leucocytaire Réalisé sur une suspension sans érythrocytes ni plaquettes (lyse) Histogramme de distribution tridimensionnel Deux axes : volume en fonction de la diffraction Code couleur donnant la 3 ième dimension : Bleu faible Vert moyen Rouge important Jaune très important GB 2, 9 % Ne 40 Ly 50 Mo 8 Eo 1 Ba 1 Année 2008 109/L 1. 15 1. 45 0. 2 0. 05 Seuils positionnant les populations normales neutrophiles lymphocytes monocytes éosinophiles Basophiles non visibles sous cette représentation Restes leucocytaires, amas de plaquettes et/ou érythroblastes Pop GB anormale (seuil mal défini entre Ly et Mo) Vérification de la formule leucocytaire sur lame Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 14