DNA Mikroarrayler fade profillemesi SNP analizleri Prof Dr

DNA Mikroarrayler: İfade profillemesi, SNP analizleri Prof. Dr. Hilâl Özdağ

Mammals Homo sapiens [NCBI 35] browse | what's new | Vega Pan troglodytes [CHIMP 1] browse | what's new Macaca mulatta [Mmul 0. 1] browse pre! site Mus musculus [NCBI m 34] browse | what's new | Vega Other chordates Gallus gallus [WASHUC 1] browse | what's new Xenopus tropicalis [JGI 3] browse | what's new Danio rerio [WTSI Zv 5] browse | what's new | Vega Other eukaryotes Drosophila melanogaster [BGDP 4] browse | what's new Anopheles gambiae [MOZ 2] browse | what's new Apis mellifera [Amel 2. 0] browse | what's new Takifugu rubripes [Fugu 2. 0] browse | what's new Caenorhabditis elegans [WS 140] browse | what's new Rattus norvegicus [RGSC 3. 4] browse | what's new Tetraodon nigroviridis [TETRAODON 7] browse | what's new Saccharomyces cerevisiae [SGcurrent browse | what's new Canis familiaris [Can. Fam 1. 0] browse | what's new | Vega Ciona intestinalis [JGI 1. 95] browse | what's new Bos taurus [Btau 1. 0] browse | what's new | pre! [Btau 2. 0] Ensembl Monodelphis domestica [Mon. Dom 2] browse pre! site

HIGH-THROUGHPUT YÜKSEK İŞLEM HACMİ Data Resources Cancer Gene Census: Mutated genes causally implicated in human cancer. COSMIC: Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer Protein Kinases: Somatic mutations in protein kinase genes. NCI-60: Mutations in cancer genes in the NCI-60 cell lines. Cancer Cell Line Project: Mutations of cancer cell lines. Copy Number Analysis: An analysis of copy number in cancer cell lines and tumours. Overview The Foundation’s Microbial Genome Sequencing Project was launched in April, 2004 after the American Society for Limnology and Oceanography meeting in Honolulu, Hawaii. The Foundation was encouraged by scientists to increase the number of genome sequences of ecologically-relevant microorganisms. Over 200 microorganisms were nominated for sequencing— 86 candidates were selected by a committee of preeminent marine microbiologists based on five selection criteria. Phase one of the project was initiated in the Fall, 2004 with a grant to the Institute of Biological Energy Alternatives (now the J. Craig Venter Institute). Auto-annotated genome sequences will be deposited in Gen. Bank. This website serves as a portal; consult Gen. Bank and the PI website for further information.

D N A’nın sabit ortama aktarımı Southern Blot (Edward M. Southern, 1975)

m. RNA Analiz Yöntemleri • Northern Blot (Tek gen analizi) • RT-PCR (Tek gen analizi) • Mikroarray (Genom boyunca analiz)

NORTHERN BLOT • m. RNA’lar boylarına göre jelde yürürler. • m. RNA’lar naylon membrana transfer edilir ve radyoaktif işaretli DNA probları ile hibridize edilir. • İşlem hacmi düşük olan bu teknikte miktar tayini hassas değildir.

RT-PCR • Total veya poly. A RNA üzerinden “reverse transcriptase” enzimi ile c. DNA sentezlenir. • Gen spesifik (ekzon) primerler ile PCR yapılır. • Özellikle eş zamanlı PCR (Real Time PCR) cihazları ile yüksek hassasiyette miktar tayini yapılabilmektedir. • İşlem hacmi northern mikroarraylerden düşüktür. blot’tan yüksek

DNA Mikroarray DNA Mikrodizin • c. DNA array: 500 -5000 bç uzunluğunda probların cam yüzeylere basılması ile üretilir. • Oligo array: 20 -80 bç uzunluğundaki oligonükleotidlerin önce sentezlenip sonra çip yüzeyine immobilize edilmesi veya doğrudan çip üzerinde sentezlenmesi (fotolitografi) ile üretilir.

DNA Mikroarray DNA Mikrodizin

DNA Mikroarray DNA Mikrodizin

Affymetrix Gene. Chip Oligo Array Hibridize olmuş prob hücresi Tek zincirli, işaretlenmiş RNA hedef molekülü Oligonük leotitt prob Oligonükleoti * * * 24µm 1. 28 cm Özgül oligonükleotit probun milyonlarca kopyası >200, 000 farklı eşlenik prob Hibridize olmuş oligo array’in görüntüsü

RNA Nitelik ve Nicelik Tayini

Affymetrix platformunda ifade analizi poly. A kontrolleri Total RNA veya Poly (A)+ m. RNA AAAA RT IVT c. DNA İşaretli c. RNA transkriptleri bio bio (bio-NTP) Fragment Hedef örneğin hazırlanışı Yıkama Tarama & Boyama Hibridize (Isı, Mg 2+) bio bio Hibridizasyon kontrolleri İşaretli fragmentler

Affymetrix

Affymetrix • About 100 pixels per probe cell • These intensities are combined to form one number representing expression for the probe cell oligo • What about genes?

Affymetrix platformunda hibridizasyon, boyama ve yıkama Biotin İşaretli c. RNA Gene. Chip Hibridize Array B B + B B B B B SAPE Streptavidinfikoeritrin

Mikroarray kullanım amaçları • Hücre metabolizmasına global bakış – Mikroarrayler vasıtasıyla bir hücreye yapılan bir uygulamanın hücreyi nasıl etkilediği hangi metabolik yolakların uyarıldığı hangilerinin sustuğu uygulama öncesine göre kıyasla ortaya konabilir. – Benzer yaklaşımla hastalıkların metabolizme üzerine etkilerinin belirlenmesi ve tedavi için hedef moleküllerin saptanması amacı ile hasta ve kontrol gruplarında mikroarrayler ile global ifade analizleri yapılabilmektedir. • Tıbbi teşhis – SNP mikroarraylerin de yardımı ile hastalığa veya hastalığa yatkınlığa neden olan genler saptanmaktadır. – 1999– 6800 insan geni içeren bir mikroarray ile myeloid lösemi ile limfoblastik lösemi 50 adet ifade farklılığı gösteren gen yardımı ile birbirinden ayrıldı. – 2003 - Meme kanseri altgruplarını saptayabilen 70 adet gen saptandı yapılan global transkriptom analizi ile.

Fonksiyonel Analiz Genlerin Nakavt Edilmesi/Gene Knockout

Fonksiyonel Analiz si. RNA

Affymetrix platformunda tarama

DNA Mikroarray DNA Mikrodizin Genomik Dizi 5´ SNP T/G 3´ SNP prob = 25 baz Perfect Match Mismatch Allel ‘A’ Perfect Match Mismatch Allel ‘B’

DNA Mikroarray DNA Mikrodizin SNP C/A TAGCCATCGGTA N GTA C TCAATGATCAGCT ATCGGTAGCCAT G AGTTACTA ATCGGTAGCCAT C CAT G AGTTACTA PM Allel MM Allel A A ATCGGTAGCCAT T CAT G AGTTACTA ATCGGTAGCCAT A CAT G AGTTACTA PM Allel MM Allel B B

DNA Mikroarray DNA Mikrodizin -4 -2 PM A -1 0 1 3 4 • • 7 Prob Çift Seti (Kuartet) SNP başına 56 olasılık Oryantasyon başına 28 Dağıtılmış yerleşim MMA Düz zincir PM B MMB PM A MMA PM B MMB 5’ 3’ 3’ 5’ Ters zincir

DNA Mikroarray DNA Mikrodizin 1 2 3 4 5 6 7 PMA PMA MMA MMA PMB PMB MMB MMB • 14 kuartet değerlendirilip en iyi 10 tanesi herbir TNP’yi temsil etmek üzere seçilir. • Seçilen bu 10 kuartet herbir TNP’nin varlığını hem düz hem de ters zincirde inceler. • Tek bir TNP’yi sorgulamak üzere toplam 40 prob kullanılmaktadır.

Tek Primer Amplifikasyonu ile Karmaşıklığın Ortadan Kaldırılması

DNA Mikroarray DNA Mikrodizin 250 ng Genomik DNA Xba Xba RE muamelesi Tek primer ile amplifikasyon Adaptörün bağlanması 4 PCR Reaksiyonu Fragmentasyon ve işaretleme Hibridizasyon Ve Tarama

DNA Mikroarray DNA Mikrodizin Mikrosatellit 10 K # Marker 400 10, 000 Çözünürlülük 10 c. M (10 MB) 1 c. M (1 MB) * # PCR Reak/örnek # PCR Primer/örnek 200 (2 x multipleks) 800 Süre (400 örnek) > 8 hafta 4 -6 hafta Belirteç başına DNA Deney başına DNA 40 ng 16, 000 ng . 025 ng 250 ng 4 1

DNA Mikrodizin Farklılıklar 100 k 10 K Dizin sayısı 2 1 Enzim sayısı 2: Xba 1 ve Hind. III 1: Xba 250 ng X 2 enzim = 500 ng 250 ng PCR Amplifikasyon Boyutu 250 -2000 bp 250 -1000 bp Fragmente edilecek miktar 40 ug 20 ug Yüksek çözünülürlüklü tarama Rutin tarama 0. 06 U/u. L 0. 048 U/u. L DM Algoritma ve GTT MPAM ve GDAS 2. 0 Asosiyasyon çalışmaları Bağlantı Başlangıç DNA miktarı Tarama Fragmentasyon reaktifinin konsantrasyonu Algoritma ve yazılım Ana uygulama alanı TNP’ler Perlegen ve Kamu

DNA Mikrodizin

DNA Mikrodizin

DNA Mikrodizin

DNA Mikrodizin <> <>

Resequencing Tiling Strategy

A C Düz zincir G T T C G C A

Custom. Seq™ Resequencing Dizinleri A C G T AGCGT A C G T ACCGT • Çip başına 30 kb çift zincirli DNA dizilimi okunabiliyor. Toplam 60 kb.

Custom. Seq™ Deney Protokolü Kontrol Kalıp/Primerler Genomik DNA Kısa Ölçekli PCR Uzun Ölçekli PCR Miktar tayini-Örneklerin Karıştırılması Fragmentasyon reaktifi Fragment İşaret Hibridizasyon için oligo kontrolleri Hibridizasyon Veri analizi

Deney Akışı İlgilen genlerin belirlenmesi Genomik DNA Karıştırma ve Fragmentasyon DNA fragmentleri PCR Ürünleri İşaretleme Geceboyu hibridizasyon B B Tarama Yıkama İstasyonu: Yıkama/Boyama B B B Sondan işaretli fragmentler

Affymetrix Custom. Seq™ Arrays 2. 5 Days Biological Sample >chr 21: 29595444 -29636248 gtggcatgatcttggctcactgcagttcaagcaattctcctgccttagc cccctgagtagctgggattacaggtgcctgctaccaccctcagctaat tttttgtatttttaatagagacggggtttcaccatgttggccaggctggtc tcgaactcctgacctcgtgattcgtctgcctcggccttccaaagtgctg ggagtacaggcatgagccaccgcacccggcctgtatatcttttttaaa aggaaaagaacatatcccagaagtttccaactgagtttccctctgggt caataccagaattgggggtcttcagctcacccctaaactcatca ttgataagcagaatgaccatggctggtttagaca………. ~30 Kb Probe Array Wash & Stain Scan

DNA Analiz Yazılımı Cihaz Kontrolü. DAT dosyasının oluşturulması GCOS . CEL dosyasının oluşturulması. CHP veri karşılaştırılması Gene. Chip DNA Analysis Software 2. 0 (GDAS)