Divisione in gruppi di 6 persone ulteriormente suddivise

VALUTAZIONE • Seminario da 0 a 6 • Domande ai componenti dello stesso gruppo

IMPACT FACTOR NATURE 25. 814 SCIENCE 23. 872 CELL 32. 44 EMBO J 13.

articoli originali rassegne “reviews” libri di testo

Watson et al. , BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S. p. A. Copyright

Altre tecniche di analisi • Estensione del primer (primer extension) • Protezione dalla S

m. RNA totale Estensione del primer (primer extension) cap m. RNA globina 3’ ibridazione

m. RNA totale Protezione da RNasi (RNase Protection) cap m. RNA globina 3’ sonda

Tecniche di analisi di interazione DNA(RNA)-Proteine • Foot-printing • EMSA (electrophoretic mobility shift assay)

Analisi interazioni DNA-proteine: saggio di footprinting

Analisi interazioni DNA-proteine: saggio EMSA

Biologia molecolare - Robert F. Weaver Copyright © 2005 – The Mc. Graw-Hill Companies

An example of a Ch. IP assay done in yeast using an antibodies raised

Sistemi di espressione • In vitro: - estratti cellulari • In vivo: - cellule

Trasfezione di cellule in coltura • transiente • stabile • vettori episomali • vettori

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• Divisione in gruppi di 6 persone (ulteriormente suddivise in 3 coppie) • Assegnazione di tre articoli originali per gruppo. Gli articoli sono divisi in tre tematiche (A, B, C) • Ciascuna coppia del gruppo sceglie uno dei tre articoli da presentare in un breve seminario secondo un calendario prestabilito. Gli altri 4 componenti del gruppo dovranno prepararsi a rispondere a domande (semplici) sull’articolo alla fine del seminario dei compagni di gruppo

VALUTAZIONE • Seminario da 0 a 6 • Domande ai componenti dello stesso gruppo di chi presenta (una per seminario) da 0 a 2 • Esame finale da 8 a 20 • Altri elementi che potranno contribuire al voto finale: 1) interventi durante la discussione dei seminari, 2) presenze

IMPACT FACTOR NATURE 25. 814 SCIENCE 23. 872 CELL 32. 44 EMBO J 13. 999 MOL CELL BIOL 9. 666 J BIOL CHEM 7. 368 EUR J BIOCHEM 2. 852

articoli originali rassegne “reviews” libri di testo

Schema trasferimento e ibridazione

Analisi di espressione (m. RNA)

Altre tecniche di analisi • Estensione del primer (primer extension) • Protezione dalla S 1/RNasi (mapping) • RT-PCR • Real time PCR

m. RNA totale Estensione del primer (primer extension) cap m. RNA globina 3’ ibridazione 5’ oligo antisenso marcato estensione con RT Analisi dei frammenti estesi su gel di sequenza frammento protetto

Protezione da RNasi (RNase Protection)

m. RNA totale Protezione da RNasi (RNase Protection) cap m. RNA globina 3’ sonda RNA antisenso ibridazione trattamento con RNasi Analisi dei frammenti protetti su gel di sequenza frammento protetto 5’

Protezione da RNasi (RNase Protection)

Tecniche di analisi di interazione DNA(RNA)-Proteine • Foot-printing • EMSA (electrophoretic mobility shift assay) • Chromatin immunoprecipitation (CHIP)

Analisi interazioni DNA-proteine: saggio di footprinting

Analisi interazioni DNA-proteine: saggio EMSA

Chromatin immunoprecipitation (Chip)

An example of a Ch. IP assay done in yeast using an antibodies raised against the gene-specific transcription factor Gal 4 and the general transcription factor and proteasome constituent Sug 1. Different PCR primers (amplifying DNA segments A-E) were employed to probe for the presence of the two proteins along the GAL 1 gene under non-inducing (raffinose) or inducing (galactose) conditions. Gal 4 is known to be localized to the promoter. Therefore, the Ch. IP signals in regions B and C for this protein reflect the presence of longer DNAs in the sample which are co-IP’d with Gal 4 and amplify using the B and C region primers. This reflects the relatively low resolution of the Ch. IP assay. Sug 1 is an elongation factor and is therefore found throughput the gene.

Coimmunoprecipitazione

Affinity co-purification (pull down)

Sistema dei due ibridi

Sistema dei tre ibridi

Sistemi di espressione • In vitro: - estratti cellulari • In vivo: - cellule in coltura - animali transgenici

Gene reporter

Vettori di clonaggio per lievito

Ricombinazione omologa

Vettori episomali

Trasfezione di cellule in coltura • transiente • stabile • vettori episomali • vettori virali