Dinmica de los componentes de membrana Dominios lipdicos

Dinámica de los componentes de membrana

“Dominios lipídicos en biomembranas” “fluído” “sólido” Klausner, Kleinfeld et al. , J. Biol. Chem. 255: 1286 (1980)

Transición gel-fluido en la bicapa fosfolipídica Tm

Efecto de la composición lipidica en las membranas a) Insaturación: Los fosfolipidos con ácidos grasos mas insaturados son mas fluidos (Tm, temperatura de transición, mas baja)

Dinámica de los lípidos de membrana - La frecuencia de rotación de un lípido alrededor de su eje es del orden de 108 /s La tasa de difusión traslacional de los lipidos de membrana es del orden de 10 -8 a 10 -7 cm 2/s. La translocación de fosfolipidos o "flip-flop" es extraordinariamente lenta (tasa de intercambio≈ 4 x 10 -5 /s). Es decir tardan horas/dias.

b) colesterol El colesterol se intercala entre los fosfolipidos -chol +chol La adición de colesterol amortigua la “fluidez” de las membranas artificiales. El colesterol fluidifica las vesículas de lecitina por debajo de Tm (<20ºC) y las rigidifica por encima.

c) Proteínas Las proteínas de membrana están "ancladas" en la bicapa lipídica. e interaccionan íntimamente con los lípidos circundantes. La actividad de muchas enzimas de membrana depende de su entorno lipídico. Esta se pierde cuando se "extraen" con detergentes y se restaura gradualmente por la adición de fosfolipidos.

Cuatro sistemas habituales de confinamiento de proteínas de membrana

Confinamiento de proteínas en una célula epitelial

Tres dominios diferentes en la membrana plasmática del espermatozoide

Dinámica de proteínas de membrana: experimentos de Frye y Edidin (1970)

Técnicas experimentales para medir la dinámica de proteínas de membrana en las células vivas FRAP: Fluorescence Recovery After Photobleaching (Recuperación de Fluorescencia Tras Fotoblanqueado) FLIP: Fluorescence Loss In Photobleaching (Pérdida de Fluorescencia En Fotoblanqueado)

Fluorescence Recovery After Photobleaching

FRAP Hepatoma marcado con un Ab anti-receptor de asialoglicoproteínas

antes durante FRAP después

FRAP y el transporte al Golgi

Fluorescence Loss In Photobleaching

Atrapamiento óptico con laser (OLT) Star Trek

Estereocilios de una célula del oido, movidos por “pinzas laser”

Transporte lateral de una proteína en la membrana plasmática según el OLT

Dominios en la membrana: Las “balsas lipídicas” (lipid rafts)

“Balsas” Lipídicas (Lipid Rafts)

Microscopía de fuerza atómica de balsas lipídicas artificiales Las balsas de SM sobresalen del fondo de dioleil-PC. Los picos amarillos son fosfatasa alcalina placentaria, una proteína GPI.

Modelo de una balsa lipídica GL SM Col “Balsa” GPI

Proteínas de membrana que se concentran en las balsas lipídicas Unión GPI Isopreniladas Aciladas

Las proteínas integrales de las balsas tienen regiones transmembrana mas largas normal plasma membrane EXTRACELULAR

Estructura de un microdominio en balsa de un linfocito T “balsa”

Algunos lípidos de membrana y proteínas colocalizan en las balsas lipídicas

Modelo de Singer y Nicholson actualizado (2004)

¿Cómo analizar si dos proteínas de membrana están próximas? Acceptor Fluorescence Resonance Energy Transfer Condiciones para que se produzca el FRET: Las moléculas donadora y aceptora deben estar muy próximas (entre 1– 10 nm). El espectro de absorción de luz del aceptor debe solaparse con el espectro de emisión de fluorescencia del donador

FRET en microscopía. Se realiza una transfección con el gen (FRET intramolecular) o los genes (FRET intermolecular) acoplados a XFPs. La aparición de FRET se analiza excitando la muestra a la l de excitación del donador y se mide la fluorescencia emitida a la l del aceptor. Si donador y aceptor están a una distancia y orientación favorable, la intensidad de la fluorescencia emitida por el donador disminuye (CFP) mientras que la del aceptor (YFP) aumenta.