Diferenciln diagnostika leukocytz v morfologick laboratoi malign leukocytzy

Diferenciální diagnostika leukocytóz v morfologické laboratoři - maligní leukocytózy D. Mikulenková Morfologicko - cytochemická laboratoř, ÚHKT, Praha,

Definice leukocytózy • Zvýšená hodnotu počtu leukocytů nad normu: dospělí WBC: 4 – 10. 109 /l

Hematopoeza

Neutrofílie Bakteriální infekce Chronické virové infekce Růstové faktory Myeloproliferativní onemocnění MDS/CMPD

blast promyelocyt tyč myelocyt bazofil tyč

promyelocyt metamyelocyt metamyelocyt myelocyt promyelocyt metamyelocyt

Lymfocytóza Virové infekce Reaktivní stavy Patologické lymfocytózy

Monocytóza Chronické infekce Poruchy imunity Hemolytické anémie MDS, MDS/CMPD AML

Eozinofílie Reaktivní (alergie, polékové, parazitární infekce, GIT, nádorové…) HES Neoplazmatické – CEL, AML, CML

Mladší eozinofily monocyt

Bazofílie Neoplastické (chronické myeloproliferativní onemocnění, MDS, AML…) Alergie, hypotyreóza, ulcerózní kolitida

Rozpočet leukocytů Doporučení ČHS – www. hematology. cz/doporuceni-chs-meze. php Absolutní počet Relativní počet Neutrofily 2, 00 – 7, 00. 109/l 45 – 70 % Lymfocyty 0, 80 – 4, 00. 109/l 20 – 45 % Monocyty 0, 08 – 1, 20. 109/l 2 – 12 % Eozinofily 0, 00 – 0, 50. 109/l 0– 5% Bazofily 0, 00 – 0, 20. 109/l 0– 2%

Hodnoty DIF z analyzátoru • • • 5 - populační diferenciál (6 - populační) WBC + bazo DIF Perox (IMI, WNR, WDF, WPC)

Hodnoty DIF z analyzátoru Fluorescenční průtoková cytometrie (DIFF) - měření velikosti a analýza vnitřní struktury leukocytů na základě vyhodnocení změn parametrů procházejícího laserového paprsku buňkou specificky obarvenou na přítomnost nukleových kyselin DNA a RNA: - velikost buňky (Forward Scatter) - hustota vnitřní struktury buňky (Side Scatter Light) - intenzita fluorescenčního úměrná aktivitě buňky a nepřímo úměrná stupni vyzrálosti buňky (Side Fluorescence Light)

myeloperoxidáza Akutní myeloidní leukemie bez známek vyzrávání (AML M 1)

Hodnoty DIF z analyzátoru Optická metoda + myeloperoxidázová aktivita leukocytů: -DIF- peroxidázový kanál -velikost buňky na ose y 1 2 3 4 5 Noise NRBC Shluky destiček Lymfocyty a bazofily „Large Unstained Cells“ (velké MPO negativní buňky) 6 Monocyty 7 Neutrofily 8 Eozinofily

DIFF – PEROX – průtoková cytometrie Cytochemická klasifikace dle myeloperoxidázové aktivity: PEROX DIF se velmi podobá tomu, co vidíte v mikroskopu Buněčný typ Myeloblasty Promyelocyty Metamyelocyty Tyče Neutrofily Eozinofily Bazofily Lymfoblasty Prolymfocyty Lymfocyty Atypické lymfocyty Monoblasty Promonocyty Monocyty Plasmatické buňky NRBC Myeloperoxidáza -, ½+ 3+ 3+ 3+ 2 -3+ 4+ 1+ -

Akutní myeloidní leukemie bez známek vyzrávání (AML M 1) 89% blastů MPO+ 92% blastů

Burkittova leukemie/lymfom (dle FAB ALL L 3) MPO negativní 50% lymfoblastů

I. Podezření na maligní leukocytózy Z analyzátorového DIF: Ø Neutrofílie s posunem doleva (CML, MDS/CMPD…) Ø Lymfo-monocytóza + anémie + trombocytopenie (akutní leukemie) Ø Lymfocytóza (leukemizované lymfoproliferativní onemocnění) Ø (LUC – peroxidáza negativní blasty, velké lymfocyty) Jen pomocné hodnocení!!!

hruška x jablko ? ? ?

II. Podezření na maligní leukocytózu Z mikroskopického hodnocení nátěru periferní krve: Ø přítomnost blastických elementů (myeloblasty, monoblasty, leukemické promyelocyty, lymfoblasty…) Ø přítomnost patologických lymfocytů Ø posun doleva až k blastům, leukoerytroblastický obraz Ø atypie erytrocytů, fragmentocyty Ø snížený počet a atypie trombocytů

MYELOBLAST – agranulární (I. typu)

MYELOBLAST – granulární (II. a III. typ)

LYMFOBLAST

LYMFOBLASTY MYELOBLAST

LYMFOBLAST (L 3)

MONOBLAST ALFA-NAFTYLBUTYRÁTESTERÁZA

LEUKEMICKÝ PROMYELOCYT

III. Podezření na maligní leukocytózu Ø Diagnóza potvrzena: ü z cytomorfologického hodnocení aspirátu KD vč. cytochemického hodnocení ü FCM vyšetření ü subcelulární vyšetřovací metody ü histopatologický rozbor kostní dřeně vč. imunohistochemie

III. LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA NA MORFOLOGICKO-CYTOCHEMICKÉ LABORATOŘI • Hodnoty KO • Nátěr PK: hodnocení 200 jaderných buněk, zhodnocení červené řady a destiček • Nátěr aspirátu KD: zhodnocení celularity, 500 jaderných buněk, trilineární hematopoeza • Cytochemické vyšetření: myeloperoxidáza (MPO), esterázy (ANBE, ANAE, NACE), Perlsova reakce na železo, PAS reakce, MPO- eoz, toluidinová modř

Maligní leukocytózy • Akutní leukemie • Chronické leukemie • Leukemizované lymfomy

IV. KLASIFIKACE AKUTNÍCH LEUKEMIÍ WHO KLASIFIKACE TUMORŮ HEMATOPOETICKÉ A LYMFOIDNÍ TKÁNĚ z r. 2008 • Akutní myeloidní leukemie • Malignity z prekurzorových B - a T- buněk • Akutní leukemie obtížně klasifikovatelné

IV. A. AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKEMIE 1. AML s rekurentními translokacemi 2. AML s myelodysplastickými změnami (z MDS, MDS/MPN, MDS s cytogenetickými změnami, či bez předchozí anamnézy) 3. Therapy- related myeloidní neoplazma (alkylační cytostatika, inhibitory topoizomerázy, jiné) 4. AML jinak nekategorizované (MO-M 7, akutní bazofilní leukemie, akutní panmyelóza s fibrózou) 5. Myeloidní sarkom (histologie) 6. Myeloidní proliferace u Downowa syndromu 7. Neoplazma z blastických plazmocytoidních dendritických buněk

IV. A. AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKEMIE 1. AML s rekurentními translokacemi t(8, 21)(q 22, q 22) - RUNX 1 -RUNX 1 T 1 inv(16)(p 13 q 22) nebo t(16, 16) - CBFbeta. MYH 11 t(15, 17)(q 22, q 21) - PML-RARA, varianty t(9, 11)(p 22, q 23) - MLLT 3 -MLL t(6, 9)(p 23, q 34) - DEK-NUP 214 inv(3)(q 21, q 26. 2) nebo t(3, 3)(q 21, q 26. 2) RPN- EVI 1 t(1, 22)(p 13, q 13) – RBM-MKL 1 AML s mutací NPM 1 AML s mutací CEBPA

IV. B. PREKURZOROVÉ LYMFOIDNÍ LEUKEMIE • Prekurzorová B lymfoblastická leukemie/ lymfom, nezařazená • Prekurzorová B lymfoblastická leukemie/ lymfom s rekurentními genetickými abnormalitami t(9, 22(, (q 34, q 11. 2) BCR-ABL 1 t(v, 11 q 23) MLL přestavba t(12, 21((p 13, q 22) TEL-AML 1 (ETV 6 -RUNX 1) s hyper- či hypodiploidií t(5, 14)(q 31, q 32) IL 3 -IGH t(1, 19)(q 23, p 13. 3) E 2 A-PBX 1(TCF 3 -PBX 1) • Prekurzorová T lymfoblastická leukemie/ lymfoblastický lymfom

IV. C. AKUTNÍ LEUKEMIE OBTÍŽNĚ KLASIFIKOVATELNÉ Obtížně klasifikovatelné akutní leukémie Akutní nediferencovaná leukémie Akutní leukémie se smíšeným fenotypem BCR-ABL 1 Akutní leukémie se smíšeným fenotypem MLL přestavba Akutní leukémie se smíšeným fenotypem B/myeloidní Akutní leukémie se smíšeným fenotypem T/myeloidní Akutní leukémie se smíšeným fenotypem jinak nespecifikované Ostatní obtížně klasifikovatelné leukemie

Co musíme umět ! • PML/RARA pozitivní akutní myeloidní leukemie - (AML M 3) (PK, KD, MPO či NACE) • AML s dysplastickými změnami (kompletní cytochemické vyšetření)

Akutní promyelocytární leukemie s t(15, 17)(q 22, q 21) • Blasty tvoří obvykle méně než 20% • Přítomnost leukemických promyelocytů i v nátěru periferní krve • Specifické cytogenetické a molekulárně genetické abnormality • Prognostický faktor - počet leukocytů, DIC • Hypergranulární (typická) a mikrogranulární forma • APL s variantními translokacemi t(11, 17) PLZF/RARA, t(5, 17) NPM/RARA

AML M 3 – hypergranulární forma

AML M 3 – mikrogranulární forma

Reparace po útlumu

AML s myelodysplastickými změnami • Většinou pancytopenie • Dysplastické změny ve 2 a více řadách u více než 50% buněk • Dyserytropoeza - multinuklearita, pulverizace, karyorexe, N/C asynchronie, megaloidní změny, makroerytroblasty, ringsideroblasty • Dysgranulopoeza- patologická granularita, pseudopelgeroidie, abnormality tvaru jádra • Dysmegakaryopeza- 3 a více či 50% mikromegakaryocytů, separace jader, hypo- či monolobularita

dyserytropoeza

dysmegakaryopoeza

V. Chronické leukemie 1. 2. 3. 4. Chronická myeloidní leukemie Chronická eozinofilní leukemie Chronická lymfatická leukemie Prolymfocytární leukemie…

CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKEMIE • • Ph+, bcr/abl pozitivita NAP snížený u 95% (v chronické fázi) Spleno- (hepato)megalie, infiltrace uzlin, měkkých tkání 3 vývojové fáze PK: leukocytóza s posunem doleva, méně než 10% blastů, normochromní a normonebo makrocytární anémie, trombocytóza, bazofílie, eozinofílie, monocytóza (u p 190) KD: hypercelulární, s hyperplazií granulo- a často i megakaryopoezy, zvýšeně bazofilní a eozinofilní prekurzory, megakaryocyty menší s hypolobací jádra (trpasličí), megaloidní změny Fáze akcelerace - progrese leukocytozy a splenomegalie, perzistující trombocytopenie či trombocytóza, v KD dysplastické změny, bazofílie Blastický zvrat - nejčastěji myeloidní, lymfoblastový, biklonální

CML periferní krev

CML chronická fáze - kostní dřeň

CML chronická fáze – kostní dřeň

CML megakaryocyty

CML pseudo. Gaucherovy buňky

CML sea- blue makrofágy

CML fáze akcelerace • • • Blasty 10 -19% jaderných buněk v PK či KD Periferní bazofílie více než 20% Perzistující trombocytopénie či trombocytóza Progrese splenomegalie a leukocytózy Cytogenetický průkaz klonální evoluce Dysplázie granulo- a megakaryopoezy

CML fáze akcelerace – periferní krev

CML fáze akcelerace – kostní dřeň

CML blastický zvrat Blasty více než 20% v PK či KD Proliferace blastů v extramedulární lokalizaci Agregáty blastů v trepanobiopsii 70% myeloidní - neutrofilní (eozinofilní, bazofilní, monocytární, megakaryocytární, erytroidní) • Lymfoblastový, bilineární, bifenotypový • •

CML myeloidní zvrat

CML lymfoblastový zvrat

CML megakaryoblastický zvrat

Charcotovy- Leydenovy krystaly

VI. Podezření na patologickou lymfocytózu Dle hodnot KO: Ø Leukocytóza s lymfocytózou Ø Normální HGB (anémie) Ø Normální počty trombocytů (trombocytopenie)

VI. Podezření na patologickou lymfocytózu Dle mikroskopického hodnocení nátěru periferní krve: Ø Přítomny patologické lymfocyty, lymfoblasty 1. ALL 2. CLL, PLL, leukemizované lymfomy, (myelom)

Morfologické dělení atypických lymfocytů 1. Reaktivní (aktivované) lymfocyty – lymfocyty reagující na infekční agens 2. Atypické (patologické) lymfocyty – lymfocyty atypické velikostí, tvarem a konturou jádra, charakterem chromatinu, atypickou barvitelností, prostorností, či konturou cytoplazmy (ALL, B - a T - lymfoproliferativní onemocnění, např. CLL, PLL, jiné leukemizované lymfomy) 3. Lymfoblasty

A. Reaktivní lymfocytózy (EBV, CMV…) 10 – 25 µm jádro kulaté, oválné, členité chromatin „rozvolněný“ početnější jadérka cytoplazma bohatá, sytěji homogenně bazofilní, více v okrajích, často nepravidelná kontura • ojediněle jemná azurofilní granula a/nebo vakuoly • • •

Plazmatická buňka Reaktivní lymfocyt

B. Maligní lymfocytózy ü Klonální leukemizovaná onemocnění z B- či T – lymfocytů, z NK buněk 1. Akutní lymfoblastové leukemie 2. Chronické lymfocytární leukemie 3. Leukemizované lymfomy

I. Neoplazma z lymfoidních B- a Tprekursorů III. M. Hodgkin IV. T- PLL, T- LGL, agresivní leukemie z NK buněk, leukemie/lymfom z T- buněk u dospělých (HTLV-1), extranodální lymfom z NK/T- buněk nazálního typu, intestinální lymfom z Tbuněk, hepatosplenický Tlymfom, panikulitický podkožní Tlymfom, blastický NK lymfom, Mycosis fungoides a Sezaryho syndrom, angioimunoblastický Tlymfom, primární kožní CD 30 pozitivní T- lymfoproliferativní onemocnění, periferní T-lymfom nespecifikovaný, anaplastický velkobuněčný T-lymfom WHO klasifikace 2008 II. CLL/SCL, B -PLL, lymfoplazmocytární lymfom/Waldenströmova makroglobulinémie, splenický lymfom z marginální zóny, vlasatobuněčná leukemie, malignity z plazmatických buněk, folikulární lymfom, lymfom z plášťových buněk, DLBCL, Burkittův lymfom/leukemie, extranodální lymfom z B – buněk, nodálním lymfom z B – buněk marginální zóny, mediastinální velkobuněčný lymfom, intravaskulární velkobuněčný lymfom, lymfomatoidní granulomatóza

Chronická lymfocytární leukemie Ø nejčastější leukemické onemocnění dospělých v západním světě Ø věk nad 50 let, převaha mužského pohlaví Ø nebolestivá generalizovaná lymfadenopatie s lymfocytózou z B lymfocytů (splenomegalie, anémie, trombocytopenie, opakované infekty)

Folikulární lymfom (FCL) Ø Neoplazma z centrocytů a centroblastů zárodečného centra lymfatických folikulů Ø LU, slezina, kostní dřeň, periferní krev, Waldayerův okruh

Lymfom z plášťové zóny (MCL) Ø Neoplazma z malých až středně velkých B-lymfocytů plášťové zóny lymfatických folikulů Ø Lymfadenopatie, hepatosplenomegalie, GIT, Waldayerův okruh

Splenický lymfom z marginální zony (SMZL) Ø Neoplazma z malých Blymfocytů Ø Slezina (marginální zona bílé pulpy), (kostní dřeň), periferní krev Ø V PK: vilózní lymfocyty (SLVL), plazmocytoidní lymfocyty

Závěr – I. • Morfologické zhodnocení buněk v nátěru PK v některých případech pomůže stanovit diagnózu (u lymfocytóz jsou morfologické změny patologických lymfocytů v nátěru PK výraznější – velikost buněk, uniformita populace, atypie jádra a cytoplazmy)

Závěr – II. • Definitivní diagnóza je stanovena z morfologicko-cytochemického hodnocení aspirátu kostní dřeně s podporou FCM vyšetření • u pacienta s patologickou lymfocytózou je definitivní stanovena dg. z FCM a histopatologického vyšetření (KD, uzliny…) • Subcelulární vyšetřovací metody (cytogentika a molgen) upřesní diagnózu a určí prognózu

Závěr – III. • Ne každá lymfo-monocytóza v hodnotách KO je pravá lymfo-monocytóza!!! • Ne každá lymfocytóza v hodnotách KO je pravá lymfocytóza!!! • Nutné je pečlivé morfologické zhodnocení nátěru PK, které ukáže směr

Děkuji za pozornost