DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA METODY MOLEKULARNE PCR Hybrydyzacja FISH Sekwencjonowanie
DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA
METODY MOLEKULARNE § PCR § Hybrydyzacja § FISH § Sekwencjonowanie
ŁAŃCUCHOWA REAKCJA POLIMERAZY Polimerase Chain Reaction (PCR) § Pozwala na powielenie dowolnej sekwencji DNA o długości od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów § Polega na przeprowadzeniu wielu cykli syntezy kwasu nukleinowego z wykorzystaniem starterów flankujących określony odcinek DNA
IZOLACJA RNA (wirusy) 1. Przygotoanie próbek krwi, skóry, włosów itd. 2. Dezintegracja komórek – TRIZOL, Chloroform 3. Odwirowanie zanieczyszczeń 4. Zamrożenie RNA (- 800 C)
MECHANIZM REAKCJI CZYNNIKI: § Jednoniciowa matryca DNA § § Startery (primery) d. NTP (trójfosforany deoksynukleotydów) § Polimeraza DNA
CYKL PCR 1. Denaturacja DNA (92 - 960 C) 2. Przyłączanie starterów do matrycy (37 -720 C) 3. Polimeryzacja DNA (720 C)
DENATURACJA (> 900 C)
PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW (37 -720 C) 3’ 5’ wana pliko Sekwencja du 5’ 3’ Primer 2 3’ 5’ Primer 1 3’ likowana p Sekwencja du 5’
WYDŁUŻANIE ŁAŃCUCHÓW (720 C) kowana pli Sekwencja du 3’ 5’ 3’ Primer 2 5’ 3’ Polimeraza Taq DNA 5’ Primer 1 dy ty Wolne nukleo 3’ 5’ owana k li p u d ja c n e Sekw
POWIELONA SEKWENCJA DNA
LICZBA KOPII SEKWENCJI DNA PODCZAS REAKCJI PRC Cykle 1 2 3 4 5 6 20 30 Liczba łańcuchów DNA 2 4 8 16 32 64 1, 048, 576 1, 073, 741, 824
PROFIL TERMICZNY PCR DENATURACJA POLIMERYZACJA PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW
METODY DIAGNOSTYCZNE OPARTE NA PCR § PCR MULTIPLEKSOWY: Równoczesna amplifikacja kilku regionów genomu w jednej probówce stosując różne pary starterów. (Diagnostyka chorób genetycznych, wykrywanie mutacji, wykrywanie czynników zakaźnych)
§ NESTED PCR: Dodanie zestawu nowych (bardziej swoistych) starterów po przeprowadzeniu wstępnej reakcji PCR. (Kontrola swoistości reakcji, stworzenie sondy molekularnej z produktu PCR) § KOMPETYTYWNY PCR: Analiza ilościowa badanego fragmentu genomu.
§ PCR-RFLP Produkt amplifikacji jest poddawany procesowi cięcia enzymami restrykcyjnymi, w wyniku czego otrzymuje się fragmenty DNA różnej długości. § RT-PCR Właściwy PCR jest poprzedzony odwrotną transkrypcją (przepisaniem informacji z RNA na DNA) dzięki enzymowi: odwrotna transkryptaza.
ODWROTNA TRANSKRYPCJA (RT-PCR) Stała temperatura (370 C) w czasie 30 min. Wyizolowane RNA Odwrotna transryptaza Nukleotydy Mieszanina RT-PCR Bufor z jonami akt. Stabilizator (DTT)
Nazwa i pochodzenie enzymu Tth Polymerase. Z Thermus thermophilus MMu. LV Rewerse. Transkryptase. Z Moloney Murine Jon aktywujący Mn++ Uwagi Termostabilna, z jonami Mg wykazuje aktywność polimerazy DNA Mg++ najpowszechniej stosowana odwrotna Transkryptaza Leucemia. Virus AMV Reverse. Transkryptase. Z Mg++ Avian Myeloblastosis. Virus Cth Polymerase Klenow Fragment. Z Carbohydrothermus hydrogenoformans Coraz powszechniej stosowana odwrotna Transkryptaza Stosowana w mieszaninie z Taq polimerazą do Mg++ jednostopniowej reakcji RT-PCR
§ ASYMETRYCZNY PCR: Dodanie pary starterów z których jeden zostaje całkowicie zużyty podczas pierwszych cykli amplifikacji DNA. (Produkt może być sondą molekularną w reakcji hybrydyzacji lub matrycą w reakcji sekwencjonowania. ) § AMPLIFIKACJA ALLELOSPECYFICZNA: Ważna jest tu komplementarność nukleotydów przy końcach 3` primerów, ponieważ umożliwia ona elongację DNA przez polimerazę. (Badanie polimorfizmu alleli, punktowych mutacji, powiązań genetycznych, wyjaśnienie działania substancji mutagennych, wykrywanie genów sprzężonych z chorobami, badanie lekooporności mikroorganizmów
ANALIZA PRODUKTÓW PCR § ELEKTROFOREZA Elektroforeza kwasów nukleinowych obecnie przeprowadzana jest głównie na żelach agarozowym i akryloamidowym oraz w tzw. płynnych (nisko spolimeryzowanych) żelach akryloamidowych w kapilarach.
§ ELEKTROFOREZA AGAROZOWA Produkt PCR pod wpływem napięcia elektrycznego wędruje w żelu agarozowym.
§ ELEKTROFOREZA AKRYLOAMIDOWA Jest powszechnie, chociaż niesłusznie uważana za bardziej precyzyjną od agarozowej oraz (słusznie) za tańszą. Zaletami tego podłoża są niskie koszta oraz możliwość wybarwiania rozdzielonych frakcji DNA poprzez srebrzenie, które daje wyraźne, widoczne gołym okiem i trwałe obrazy.
Wybarwianie elektroforetycznie rozdzielonego na żelu DNA może być przeprowadzane za pomocą bromku etydyny lub innego, podobnego barwnika (np. SYBR Gold, który jest o wiele czulszy lecz znacznie droższy), natomiast w przypadku elektroforezy kapilarnej szczególnie popularne jest wielokolorowe barwienie fluorescencyjne, wykorzystujące wzbudzoną laserem fluorescencję wbudowanych w łańcuch DNA fluorochromów.
HYBRYDYZACJA Wykorzystuje sondy molekularne (kwas nukleinowy o określonej sekwencji), będące odcinkami komplementarnymi do szukanych fragmentów genomu. Najważniejsze typy to: Southern blotting - badanie DNA Northern blotting – badanie RNA
SONDY MOLEKULARNE
SONDY MOLEKULARNE
Mikromacierz nylonowa (powiększenie) 4 x 5 mm Mikromacierz nylonowa 8 x 12 cm
§ HYBRYDYZACJA in situ (FISH) Pozwala zlokalizować sekwencję kwasu nukleinowego w komórce lub odpowiednim rejonie chromosomu. Znakomita większość sond wykorzystywanych w metodzie FISH znakowana jest bezpośrednio fluorochromem. Najczęściej stosowanymi fluorochromami są fluoresceina (FITC), rodamina, czerwień teksańska (Texas Red) i Aqua (DEAC).
Obraz chromosomów komórek linii raka prostaty Metoda M-FISH Hybrydyzacja in situ multipleksowa
§ SEWENCJONOWANIE: Polega na określeniu sekwencji nukleotydów. Metoda chemiczna – chemiczne rozszczepianie kolejnych nukleotydów badanego fragmentu DNA. Metoda enzymatyczna (Sangera) – synteza komplementarnej nici DNA na matrycy wykorzystująca system znakowania trójfosforanów czterech dideoksynukleotydów fluorochromami w czterech różnych kolorach, są 3 warianty:
1. Dye Primer Sequencing - przeprowadza się cztery niezależne reakcje PCR z czterema porcjami primera, każda porcja znakowana jest fluorochromem w innym kolorze. Produkty czterech reakcji miesza się i analizuje wspólnie. 2. Cycle Sequencing - startuje się z bardzo małą ilością DNA, przeprowadza reakcję PCR, a po każdej denaturacji termicznej uzyskuje się coraz dłuższy łańcuch zakończony znakowanym nukleotydem. 3. Dye Terminator Sequencing - używa się mieszanki nie znakowanych trójfosforanów nukleotydów i znakowanych trójfosforanów dideoksynukleotydów. Była stosowana przez konkurujące zespoły naukowe które z sukcesem zakończyły sekwencjonowanie genomu człowieka.
Schemat automatycznego sekwencjonowania DNA Starter komplementarny do matrycy DNA 3’ 5’ GCCTAGGGTTTGCGCTAC 3’ CGGATCCCAAACGCGATGCAGGCATGCAATGACC d. ATP d. GTP d. TTP d. CTP 5’ dd. ATP dd. GTP dd. TTP dd. CTP Terminatory znakowane fluorescencyjnie Wydłużanie startera przy użyciu polimerazy DNA Rozdział produktów reakcji w automatycznym sekwenatorze Detektor Lase r GTCCGTACGTTACTGdd. G GTCCGTACGTTACTdd. G GTCCGTACGTTACdd. T GTCCGTACGTTAdd. C GTCCGTACGTTdd. A GTCCGTACGTdd. T GTCCGTACGdd. T GTCCGTACdd. G GTCCGTAdd. C GTCCGTdd. A GTCCGdd. T GTCCdd. G GTCdd. C GTdd. C Gdd. T dd. G
- Slides: 34