Diagnostyka laboratoryjna w endokrynologii Zbigniew Bartoszewicz Co rzeczywicie

Diagnostyka laboratoryjna w endokrynologii Zbigniew Bartoszewicz Co rzeczywiście mierzymy metodami immunochemicznymi? Przykłady interpretacji wyników dla autoprzeciwciał i hormonów białkowych. Normy, standaryzacja Agnieszka Kondracka Oznaczanie frakcji hormonów wolnych, biodostępnych i całkowitych. Pracownia Naukowa Katedry i Kliniki Chorób Wewnętrznych i Endokrynologii SP CSK WUM w Warszawie Kierownik Kliniki prof. dr hab. med. Ewa Bar-Andziak

Stan kliniczny pacjenta a wyniki laboratoryjne PACJENT LEKARZ NORMA KLINICZNA wyniki badań laboratoryjnych stan kliniczny Diagnostyka Laboratoryjna Dostarcza informacji na temat stanu zdrowia chorego na podstawie Jaki materiału materiał? biologicznego badań Sposób pobrania? próbka DIAGNOST A NORMA LABORATORYJNA

Materiał biologiczny pobierany: Metodami nieinwazyjnymi Ślina Mocz i kał Komórki nabłonka Naskórek Włosy Paznokcie Wydychane powietrze Metodami inwazyjnymi Cały pacjent Krew (surowica, osocze) Komórki i tkanki (biopsje, resekcje) Szpik kostny Wewnętrzne płyny wydzielnicze Mózgowo-rdzeniowy Stawowy (wysiękowy) Surowiczy Owodniowy Przewodu pokarmowego

Metody immunochemiczne (1) Wszystkie analityczne metody immunochemiczne przeznaczone są do identyfikacji antygenów i przeciwciał Ag antygen Ab przeciwciało Stężenie zdecydowanej większości hormonów jest oznaczane metodami immunochemicznymi

Metody immunochemiczne (2) Jakie substancje chemiczne możemy oznaczać? Każdą substancję, przeciwko której jesteśmy w stanie wyprodukować przeciwciało a w przypadku oznaczania przeciwciał jesteśmy w stanie wyizolować antygen • Większość substancji istotnych z klinicznego punktu widzenia: - białka (w tym przeciwciała) , peptydy glikobiałka, glikopeptydy - hormony niebiałkowe (np. tarczycy FT 3, FT 4), hormony sterydowe (np. DEHAE-S, kortyzol) - leki i ich metabolity, witaminy - lipidy, cukry (np. glikowana hemoglobina) - materiał genetyczny (DNA, m. RNA)

Metody immunochemiczne (3) W jakim materiale biologicznym oznaczamy ? Nazwa metody Materiał do analizy Testy immunodiagnostyczne (immunoassay) Surowica i osocze krwi, płyny wysiękowe (np. z jamy stawowej), płyn z opłucnej, płyn mózgowo- rdzeniowy, mocz, ślina Immunocytochemia (komórki) Komórki Immunohistochemia Tkanki, biopaty Hybrydocytochemia (technika FISH sonda znakowana fluor. DNA lub RNA preparatów mikroskopowych Bloting, bloting in situ Homogenat materiału tkankowego lub komórek, tkanki

Metody immunochemiczne (4) Zasady działania Podstawowa zasada działania wszystkich analitycznych metod immunochemicznych polega na utworzeniu kompleksu ( wiązania) przeciwciało - antygen Ag + Ab ka kd Ag-Ab Zależność od: - p. H - Temp - Siły jonowej + Warunkiem koniecznym do prawidłowego oznaczenia analitu metodą immunochemiczna jest wysoka jakości użytego przeciwciała lub/i antygenu

Testy immunochemiczne heterogenne 1) Adsorpcja (opłaszczanie) na powierzchni fazy stałej

Metody immunochemiczne (5) Antygenem nazywamy substancję, która sama (immunogen) lub po sprzężeniu (hapten) z odpowiednim nośnikiem po wprowadzeniu do organizmu obcego jest w stanie wytworzyć przeciwciała oraz swoiście się z nimi wiązać Nie każdy antygen jest immunogenem Reakcje: • lektyna – determinanta cukrowa • hormon-receptor nie są reakcjami immunologicznymi Antygenem może być immunogenna substancja nierozpoznawalna przez układ immunologiczny organizmu jako własna Autoantygeny

Antygeny – immunogeny w endokrynologii v„Dobre” immunogeny - duże białka Tg, TSH, NIS, r. TSH, TPO v„Średnie” immunogeny – małe białka, peptydy, glikopeptydy PRL, h. GH, LH. FSH, insulina v. Hormony słabo lub nieimmunogenne -hormony sterydowe (T, cort, Prog, 17 -OH prog), f. T 3, f. T 4 - polisacharydy Im większy ciężar cząsteczkowy antygenu i bardziej zróżnicowana jego struktura tym lepszym jest immunogenem

Zmienność antygenów – izoformy N 1. 2. Różne kopie genów (splicing) Postranslacyjne modyfikacje v Glikozylacja 3. Epitopy v ciagłe 3 -6 aa v nieciągłe (przestrzenne) 12 -15 aa v Fosforylacja i sulfatacja v Proteoliza v Tworzenie się agregatów v Deamidacja

Metody immunochemiczne (6) Typy odpowiedzi immunologicznej Odpowiedź komórkowa Odpowiedź humoralna

Produkcja przeciwciał (KLH) –keyhole limpet hemocyanin sprzęganie Immunogen Antygen (hapten) + nośnik (BSA )– bovine serum albumin Przeciwciała poliklonalne Przeciwciała monoklonalne Hodowla szpiczaka Immunogen + emulgator Kolejne immunizacje Przeciwciała Ig G Podstawowe cechy „dobrego” przeciwciała: v selektywność (swoistość) do antygenu (ka ) v brak reakcji krzyżowych ze związkami zbliżonymi strukturalnie do antygenu v niskie wiązanie niespecyficzne (NSB)

Fc Znacznik Fab Cechy znakowania: v ilość, jakość znacznika zwiększająca czułość E 1 E 2 v znakowanie powinno zmieniać własności przeciwciał (selektywność, siła wiązania, reakcje krzyżowe) oraz antygenu (maskowanie epitopów, struktura przestrzenna)

Rodzaje techniki pomiarowej - znaczniki Rodzaj znacznika Nazwa metody Bez znacznika Immunoelekroforeza, immunodyfuzję radialną. neflometria, turbidymetria – bezpośredni pomiar kompleksu immunologicznego Radioizotopy: J 125, Co 57, H 3, C 14 RIA - (Radio. Immuno. Assay - radioimmunologiczna) IRMA (Immuno. Radio. Assay - immunoradiometr. ) Enzymy: fosfataza alkaliczna, peroksydaza chrzanowa, -Dgalaktozydaza EIA - (Enzyme. Immuno. Assay - immunoenzymatyczna) Fluorofory: fluresceina, FIA kumaryna, europ Eu+3, terb Tr+3 Luminofory: estry akrydyny, pochodne izoluminolu - (Fluorecsence. Immuno. Assay) LIA / CLIA - (Chemi. Luminescence. Immuno. Assay) ECL / ECLIA - (Ele ktro. Chemi. Luminescence. Immuno. Assay) Ligandy: biotyna, awidyna, digoksygenina, lektyny

Liniowość metod (zakres pomiarowy) ECL LIA FIA EIA RIA 0 2000 4000 6000 8000 10000

Testy do oznaczania TSH Kolejne generacje testów w zależności od czułości analitycznej Testy I generacji m. U/ml - < 1, 0 Testy II generacji - < 0, 1 m. U/ml Testy III generacji - < 0, 01 m. U/ml

Test bezpośredni Ag (immunohistochemia)

Test pośredni Ag (immunohistochemia) + Ag + Ab Ag-Ab + IIAb znakowane przeciwciało anty-Ab Ag-Ab-IIAb*

Test Pośredni Ab (autoprzeciwciała tarczycy) + a. TPO Ag + Ab Ag-Ab + a. TPO Ag-Ab + IIAb znakowane przeciwciało anty-Ab Ag-Ab-IIAb* Zastosowanie: Oznaczanie autoprzeciwciał

Normy dla ATPO, ATG i TBII Test i producent Wynik Negatywny Pozytywny Zakres pomiarowy < 100 IU/ml > 190 IU/ml <225 IU/ml > 325 IU/ml < 115 U/ml < 34 IU/ml < 115 IU/ml 60 – 5000 ? 5 – 7500 2 - 1000 10 – 4000 < 100 IU/ml <16 IU/ml 30 – 2500 ? ATG Diamed (ELISA) Cogent Diagnostics(ELISA) Brahms (LUMItest) Abbott/AXSYM (MEIA) Roche/ELECSYS (ECLIA) ATPO Diamed (ELISA) Cogent Diagnostics (ELISA) Brahms (LUMItest) Abbott/AXSYM (MEIA) Roche/ELECSYS (ECLIA) TBII (TRAb) Brahms (LUMItest TRAK) Roche/ELECSYS (ECLIA) > 190 IU/ml > 24 IU/ml < 60 U/ml < 12 IU/ml < 63 IU/ml < 1, 0 IU/l <1, 5 5, 5 – 3000 1 1000 5 -600 > 1, 5 IU/l >1, 75 IU/l 0, 1 – 40 0, 3 - 40

Czynniki wpływające na wartości referencyjne (norma, wartości odcięcia, wartości graniczne, wartości decyzyjne) Czynniki genetyczne (rasa) dh. alk. Wiek, płeć (T, PRL) Czynniki środowiskowe (ATG) Cykl dobowy ACTH, kortyzol, PRL, GH Otyłość zmienia dobowy rytm ACTH, kortyzol Niedożywienie oraz dieta wegetariańska Aktywność, pozycja ciała aldosteron Stres i stany pooperacyjne podwyższają stężenie ACTH i kortyzolu w ciągu 15 min, normalizacja następuje w 8 -10 godz. po ustaniu stresu. Doustna antykoncepcja czy HTZ u kobiet zmieniają wyniki oznaczeń tyroksyny i kortyzolu Warunki laboratoryjne (gł. metody manualne)

Czynniki wpływające na zróżnicowanie wyników anty. TPO i anty. TG v Natura autoprzeciwciał v. Trudność z definiowaniem stężenia odcięcia dla wyników pozytywnych v. Brak międzynarodowych wzorców v. Zróżnicowanie metod otrzymywania autoantygenu v. Różnorodność analityczna w procedurach testów (np. typ płukania 1 lub 2 -stopniowe wpływa na dokładność wyników) 1. Tozzoli, R. et al. (2002). Clin. Chem. Lab Med. , Jun; 40(6): 568 -73

Zróżnicowanie metod otrzymywania autoantygenu v. Antygeny otrzymywane z tkanki zwierzęcej v Antygeny rekombinowane v Antygeny ludzkie a. TPO h. TPO

Metody z ograniczona ilością przeciwciała Niedomiar przeciwciała wychwytującego (kompetycyjne) + + Ab Ag Ab-Ag Ag* Ab-Ag* + Zastosowanie: niskocząsteczkowe hormony sterydowe, T 3, T 4, PRL

Metody z nadmiarem odczynnika metody niekompetycyjne- kanapkowe (sandwich assay) Nadmiar przeciwciała wychwytującego + Ab 1 + E 1 Ab 1 -Ag + E 1 Ag E 2 + Ab 2* E 1 E 2 Ab 1 -Ag-Ab 2* Zastosowanie np. Intact PTH

Co chemy a co rzeczywiście mierzymy metodami immunochemicznymi? Cel Pomiar Stężenie Interferencje Hormonu A Czy hormon A jest homogenny? Czy przeciwciała użyte w teście rozpoznają substancje inne niż hormon A?

Interferencje w metodach immunochemicznych Interferencje w diagnostyce laboratoryjnej można określić jako wpływ substancji obecnej w próbce badanej, polegający na zmianie prawidłowej wartości wyniku danego parametru wyrażonego zwykle jako stężenie lub aktywność q Efekty matrycowe (im mniejsza objętość próbki w stosunku do mieszaniny reakcyjnej tym mniejsze prawdopodobieństwo interferencji q Heterogenność oznaczanego analitu w próbce q Reakcje krzyżowe – wiązanie się przeciwciała z substancją inną niż analit q. Czynniki wpływające na zmianę stężenia hormonu (np. leki, stres, infekcje, alergie, zakażenia, dieta)

Heterogenność hormonów glikozylacja, fosforylacja Autoprzeciwciała, przeciwciała heterofilne białka wiążące Agregaty i prohormony Izoformy o podobnym ciężarze cząsteczkowym W jakim stopniu heterogenny hormon A jest rozpoznawalny w teście immunochemicznym ? Hormon A Wynik? Enzymy proteolityczne metabolity Produkty degradacji

Heterogenność oznaczanego hormonu (1) (PRL) Roche Elecsys Beckman Access

Heterogenność oznaczanego hormonu (2) IZOFORMY PROLAKTYNY CIĘŻAR CZĄSTECZK OWY (k. Da) AKTYWNOŚĆ BIOLOGICZNA (liczona względem formy monomerycznej) WYSTĘPOWANIE i WŁASNOŚCI Fragmenty 16 22 -23 ? 100% Wiąże się z krótką rozpuszczalną formą receptora PRL Zwykle stanowi 85%-95% całkowitej PRL w surowicy ludzi zdrowych Proteolityczne Monomeryczne Podstawowa „little PRL” Glikozylowana 25 zwykle niższa lub niezmieniona Może być formą dominującą w trzecim trymestrze ciąży. W hiperprolaktynemii jej ilość maleje wraz z nasileniem objawów Do 10% całości prolaktyny w surowicy, gł. dimery Dimery „big PRL” (b- PRL) duża cząsteczka PRL 50 -60 Niższa lub porównywalna „big-big PRL” (bb. PRL) bardzo duża cząsteczka PRL „ultra big PRL makroprolaktyna (kompleksy PRL z przeciwciałami Ig. G) Mniejsza lub nawet zerowa w porównaniu z monomeryczną PRL Dominujące w ok. 25% hiperprolaktynemii idiopatycznej, 2. 9% ciąży (3 trymester), obecne w prolaktinoma Agregaty > 100 150 -170 lub >

Heterogenność oznaczanego hormonu (3) Oznaczanie makroprolaktyny metodą z PEG-iem (1) Podwyższony poziom prolaktyny w surowicy: - Precypitacja 1: 1 surowicy z 25% PEG-6000% PEG 6000 w stos. 1+1 v po 10 min. odwirować przy 2000 g przez 5 min. v oznaczyć w supernatancie poziom prolaktyny v obliczyć % odzysku w stos. do próbki natywnej: [stęż. PRL po precyp. z PEG] x 2 % odzysku = 100 x [stęż. PRL w próbce natywnej]

Heterogenność oznaczanego hormonu (5) Degradacja hormonów pod wpływem enzymów proteolitycznych Epitop 2 E 2 B Enzymy proteolitycze A E 1 E 2 Test kompetycyjny A+B C Epitop 1 E 1 A+C Który fragment jest bioaktywny? Który fragment ma znaczenie diagnostyczne?

Heterogenność oznaczanej substancji (6) Degradacja hormonów pod wpływem enzymów proteolitycznych Epitop 2 E 2 A E 1 B E 1 E 2 Test kanapkowy Enzymy proteolityczne E 2 Tylko A C Epitop 1 E 1 A+C

Degradacja cząsteczki PTH pod wpływem enzymów proteolitycznych Pre-pro. PTH Intact-PTH (i-PTH) 1 -84 bioaktywny N-PTH 1 -34 N 7 -84 N Brak aktywności biologicznej C-PTH 35 -84 C C Nagromadza się w niewydolności nerek Mid-molecule PTH 35 -64 44 -68 C Nagromadza się w niewydolności nerek

Oddziaływania z prekursorami hormonów (pro-hormonami) Degragacja cząsteczki proopiomelanokortyny (POMC) przez konwertazy prohormonalne PC 1 i PC 2 1 241 N- Pro-opiomelanokortyna ACTH (POMC) -C PC 1 1 150 153 241 Pro-ACTH -LPH PC 1 1 78 112 150 N-POC JP PC 2 ACTH PC 2 79 108 PC 2 51 76 112 124 130 153 208 211 241 g 3 -MSH αMSH CLIP g-LPH β-EP Człowiek Inne ssaki

Aktywność biologiczna prekursorów i fragmentów hormonu adenokortykotropowego (ACTH) v Propiomelanokortyna (POMC) 1 -241 v pro-ACTH - niska aktywność biologiczna 1 -150 8 -100% bioaktywności ACTH w zależności od metody pomiaru 1 39 N- -C ACTH 100% bioaktywności 1 18 19 39 1 -18 100% bioaktywności 19 -39 Niska bioaktywność ale ma wpływ na okres połowicznego rozpadu ACTH 1 24 (1 -24) ACTH 100 % bioaktywności Syntetyczny ACTH (synacthen)

Reakcje krzyżowe Nawet najlepsze przeciwciała nie są całkowicie selektywne i mogą dawać reakcje krzyżowe z antygenami o zbliżonej budowie Metody eliminacji reakcji krzyżowych: v izolacja ligantu przed oznaczniem (ekstr. peptydów na kol. Sep-PAK) vzmiana warunków reakcji (temperatury, czasu inkubacji) v destrukcja substancji interferującej v zmiana przeciwciał na bardziej swoiste

Hormony Co rzeczywiście mierzymy metodami immunochemicznymi? v Hormony v. Ich prekursory (prohormony) v Produkty proteolitycznego rozpadu v Agregaty v Hormony zmutowane v Hormony homologiczne v Inne anality reagujące z przeciwciałami używanymi w teście

W jednym laboratorium wynik stężenia PRL pacjentki o godz 9: 23 wyniósł 33, 28 ng/ml W tym samym dniu o godz 10: 27 w innym laboratorium wynik stężenia PRL tej samej pacjentki wyniósł 111, 41 ng/ml Czy z medycznego punktu widzenia możliwe jest aby pacjentka w tym samym dniu miała dwa diametralnie różne wyniki poziomu prolaktyny przy prawidłowo działającym sprzęcie ? Czy znane były warunki pobrania krwi do oznaczeń dla obu laboratoriów? Czy ustalono producenta i rodzaj testów do oznaczeń prolaktyny zastosowanych w obu laboratoriach? Czy sprawdzono wyniki kontroli wewnętrznej oraz kalibracji prolaktyny dla tych testów, na którym wykonano oznaczenie prolaktyny pacjentki w obu laboratoriach w dniu oznaczenia?

Cechy idealnego międzynarodowego wzorca dla hormonów białkowych q Powinien być czysty chemicznie i trwały (uwaga na glikobiałka) q Powinien odzwierciedlać możliwą heterogenność hormonów (różny poziom pro-hormonów, podjednostki, fragmenty, kompleksy, podtypy) q Powinien być łatwo i przez długi okres dostępny q Stężenie powinno być wyrażone w jednostkach układu SI (mole/l) lub jednostkach międzynarodowych U/l Jednostki zajmujące się standaryzacją: - Expert Comittee on Biological Standarization (ECBS) przy WHO - Institute for Reference Materials and Measurments (IRMM) - Bureau Communautaire de Reference (BCR) - National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) - National Comittee for Clinical Laboratory Standarization (NCCLS)

Standardy i kalibratory Pierwotny materiał referencyjy materiał wykazuje własności na tyle homogenne i dobrze zdefiniowane aby mógł służyć do kalibracji aparatu, oceny pomiaru lub ustanowienia wartości. Może to być czyste białko (rekombinowane lub oczyszczone ze zlewkowej surowicy ludzkiej) według jednoznacznie opisanej procedury. Powinien mieć długą trwałość a jego ilość przygotowana jednorazowo powinna wystarczyć na minimum kilkanaście np. 30 lat. Wartości tego białka określone są metodami definitywnymi ( metody najbardziej precyzyjne zgodne z aktualnym stanem wiedzy nadające się dla wszystkich wzorców Drugorzędowy materiał referencyjny jego wartości odpowiadają standardowi pierwotnemu ale są określone przy zastosowaniu metod referencyjnych (np. metoda rozcieńczeń izotopowych połączonej z GC i MS (ID-GCMS). Pożądane własności : akceptowalny (certyfikowany) na forum międzynarodowym ( np. hormony: LH, FSH, PRL, TSH); szeroko dostępny, stabilny i dobrze sprecyzowany możliwie oparty na surowicy ludzkiej o własnościach zbliżonych do substancji natywnych w surowicy o podobnych własnościach dla różnych metod; otrzymywany w precyzyjnie ustalonych protokołach produkcji Materiały kontrolne (kalibratory, standardy firmowe) np. dla T, Prog. , Estriolu, FT 3, FT 4). Służą do rutynowej wewnętrznej kontroli jakości: krótszy okres trwałości (kilka miesiecy) gorzej sprecyzowane i akceptowalne na zewnątrz laboratorium

Przeciwciała stymulujące w chorobie G-B M. Jakóbisiak 1998 R. Di Lauro, M. De Felice 2001

Thyrotropin receptor autoantibodies (TRAbs) Autoantibody Mechanism of action Clinical effect Stimulating the thyroid TSI (thyroid stimulating immunoglobulins) TSAb (thyroid stimulating antibodies) Blocking the thyroid stimulation TBAb (thyroid blocking antibodies) TSBAb (thyroid stimulating-blocking antibodies Stimulating TSH-R in substitution of TSH or incrasing the TSH effectiveness, increasing the receptor half-life Hyperthyroidism in G-B Hyperthyroidism of infants Blocking the TSH-R activation by TSH and stimulatory antibodies. Blocking the binding the TSH and antibodies to TSHR Blocking the binding of TSH to TSH-R TBII (TSH binding inhibitory immunoglobulins) TBIAb (TSH binding inhibitory antibodies) Stimulation the thyroid growth TGI (thyroid growth immunoglobulins, thyroid growth stimulating immunoglobulins) Inhibit the thyroid growth TGI-block (thyroid growth immunoglobulin blocking Neutral Blocking the binding of TSH to its receptor. Can stimulate or inhibit the receptor activity by ligands Present in different autoimmune thyroid inflamation, in majority of patients with G-B, May produce hypothyroidism Present in G-B, autoimmune thyroid diseases Multifunctional Questionable. There is no evidence that TSH-R is the only antigen, c. AMP is not a messenger. Present in G-B There is no evidence that the TSH-R is an antigen Present in hypothyroidism Binds TSH-R but doesn’t influence its function Binds TSH-R Present in G-B, lack in healthy individuals Not known

Pomiar stężenia przeciwciał TBII (kompetycyjne) TBII – przeciwciała blokujące miejsce wiązania TSH do jego receptora Niedomiar związanego przez MAb natywnego TSH-R TSH n. TSH-R MAb TSH + + TSH MAb n. TSH-R + + TSH n. TSH-R MAb TSH

TPO i TG są głównymi autoantygenami AITD Peroksydaza Tarczycowa TPO Enzym konieczny do syntezy T 3 i T 4 Tyreoglobulina Tg Białko na którym T 3/T 4 są syntetyzowane Przeciwciała generowane w chorobach tarczycy: q Choroba Hashimoto q Choroba Graves’a Nohr S. B. et al. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85: 3191 -8.

Metody kompetycyjne a niekompetycyjne (1) Wszystkie immunochemiczne metody kompetycyjne opierają się naantygen pomiarze Znakowany niezajętych przez analit Analog antygenu Przeciwciało blokujące miejsc na cząsteczkach przeciwciała wychwytującego

Metody kompetycyjne a niekompetycyjne (2) Wszystkie immunochemiczne metody niekompetycyjne opierają się na pomiarze zajętych przez analit miejsc na cząsteczkach przeciwciała wychwytującego