Diagnostika vybranch skupin mikroorganism Martina Sittov Klinick aplikace

Diagnostika vybraných skupin mikroorganismů Martina Sittová

Klinické aplikace metod molekulární mikrobiologické diagnostiky - výhody metody • Kultivačně nezávislé - detekce a identifikace nekultivovatelných a obtížně kultivovatelných, usmrcených a poškozených mikroorganismů (M. tbc. , chlamydie, borelie, viry) • Vysoká citlivost (HCV, HBV, gonokoky, M. tbc) • Rychlá detekce (M. tbc, meningitidy, sepse, . . ) • Možnost vyšetřit jakékoliv klinické vzorky i bez ohledu na transportní podmínky • Možnost kvantitativního provedení (HCV, HIV, HBV, CMV)

Klinické aplikace metod molekulární mikrobiologické diagnostiky – limity metody • Problém standardizace metod • rozdílné přístupy laboratoří v in-house technikách • Použití standardizovaných komerčních kitů (CE-IVD) • Klinická interpretace • Někteří klinici metodu stále neznají a neumí používat • metody jsou ve stadiu získávání poznatků k interpretaci výsledků • nové vlastnosti metod (citlivost, nezávislost na kultivaci), mění pohled na infekci některými patogeny - borelie, „mrtvé patogeny“, …. • Často není interpretační rámec např. pro vysokou citlivost metody • Cena - při nesprávné indikaci vysoká • Nízká informovanost kliniků – neznalost přínosu metody nebo až přehnaná očekávání „poškozují dobrou pověst“ těchto nových metod

Diagnostika mikroorganismů • Pohlavně přenosné choroby – Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae genitální mykoplazmata/ureaplazmata • Respirační infekce – Mycobacterium tuberculosis komplex, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Mycoplazma pneumoniae, Bordetella pertussis; • Původci sepsí a generalizovaných mykóz – metody univerzální detekce bakterií a hub, detekce specifických bakterií a mikromycet (stafylokoky, streptokoky, meningokoky, aspergily, kvasinky rodu Candida apod. ) • Zoonózy, neuroinfekce, oční infekce – Borrelia burgdorferi s. lato, toxoplazma

Pohlavně přenosné choroby (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, HIV)

Chlamydia trachomatis • Intracelulární patogen (při množení se uvolňuje) • Jedna z nejběžnějších STD – CHT přítomny na sliznicích, ve spermatu, v moči • Testování spermatu pro IVF • Onemocnění: chronické infekce v oblasti pánevní, respirační infekce (děti), oční infekce • Z krve se nediagnostikuje

Diagnostika CHT • Průkaz antigenu, sérologické metod, kultivace se rutinně neprovádí • PCR – zlatý standard

CHT PCR • Klinický materiál: stěry z cervixu, uretry, rekta, rohovky, moč, sperma • Kvalitativní detekce • Cíl: kryptický plazmid (multikopiový cíl) a/nebo konzervativní úsek DNA genu 16 S r. DNA

RNA database project • https: //rdp. cme. msu. edu/

Neisseria gonorrhoeae • Kultivačně náročný aerobní diplokok • Onemocnění – kapavka, faryngitida, tonsilitida

Diagnostika NG Kultivace PCR • Čokoládový agar popř. v kombinaci s antibiotiky pro určení citlivosti • Výsledek možno odečíst po 24 hodinách, ale negativní lze konstatovat až po 48 hodinové kultivaci • Kvalitativní detekce • 6 hodin

PCR NG • Klinický materiál – moč, výtěr z uretry, rekta, cervixu, sperma • Kvalitativní detekce • Cíl detekce: 16 S r. DNA a/nebo Por. A pseudogen, DR-9

Austrálie - rok 2011 • V dubnu 2011 přijat na kliniku sexuálních chorob v Newcastlu mladý muž s análními bolestmi. • Uvedeno několik sexuálních kontaktů s muži (MSM) • Proveden odběr moči a dále faryngeální a rektální výtěr. Oboje odesláno na vyšetření N. gonorrhoeae: § Moč a rektální výtěr testovány pomocí analýzy nukleových kyselin § Stejný rektální výtěr testován kultivačně a izolát z kultivace dále analýzou nukleových kyselin Výsledek detekce byl znepokojující…

Detekční cíl Přímá repetice DR-9 POZITIVNÍ Detekční cíl por. A pseudogen NEGATIVNÍ

Případ II Fenotypově byly izoláty z kultivace charakterizovány jako N. gonorrhoeae Byla provedena sekvenace úseku por. A pseudogenu o délce 773 bp:

Případ II V úseku por. A pseudogenu, do kterého je cílena většina systémů pro detekci N. gonorrhoeae nalezeny významné nukleotidové záměny Tyto změny v sekvenci vedly k falešně negativní detekci N. gonorrhoeae při použití PCR soupravy cílené do por. A pseudogenu.

Borrelia burgdorferi • spirálovité bakterie stavbou buněčné stěny podobná G • Přenáší se členovci • Onemocnění: lymeská borrelióza • Diagnostika BB: Kultivace, mikroskopie v zástinu, ELISA, western-blot • Kvalitativní detekce pomocí PCR

BB PCR • Klinický materiál: plná krev, mozkomíšní mok, moč, klíště, synoviální tekutina • V průběhu onemocnění není mnoho period, kdy lze borélie v dostupném vzorku přímo prokázat. Je-li výsledek PCR pozitivní, je spolehlivým markerem boreliózy. Ke stanovení stádia onemocnění je nutná kombinace se stanovením protilátek v séru nebo likvoru. • Kvalitativní detekce: včasný záchyt borélie před vznikem protilátek • Cíl detekce: konzervativní úsek DNA genu 16 S r. DNA

kauzistiky • • • Neuroborelióza: šestiletá dívka hospitalizovaná na počátku února pro parézu lícního nervu na interně v Boskovicích nervové příznaky a lehce zvýšené teploty serologie na neuroinfekce negativní kultivace a mikroskopie likvoru negativní PCR z likvoru, krve a moče - pozitivní jen v likvoru a moči - potvrzeno pozit. intratékálními protilátkami a Western-blotem dlouhodobá léčba ATB do úplného vymizení symptomů (latence nevyloučena)

Viry

Diagnostika virů • Jakýkoliv virus • Inaprentní infekce, latentní infekce, koinfekce (HPV+HIV) • Vysoká mutační rychlost (RNA viry) • Rutinně detekované viry - Herpetické viry – herpes simplex virus 1 a 2 (HSV 1, HSV 2), varicella – zoster virus (VZV), Epstein-Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV), lidský herpesvirus 6 (HHV 6), lidský herpesvirus 7 (HHV 7), lidský herpesvirus 8 (HHV 8); parvovirus B 19; • Viry hepatitid – virus hepatitidy C (HCV), virus hepatitidy B (HBV); papilomavirus (HPV) + typizace „high risk“ skupiny; virus lidského imunodeficitu (HIV), typy 1, 2; lidský leukemický virus HTLV; virus chřipky H 5 N 1 (varianta tzv. ptačí chřipky); • Experimentálně detekované viry – enteroviry, adenoviry, BK virus, JC virus, SARS koronavirus, influenza, flaviviry (virus klíšťové encefalitidy, TBEV).

Virus hepatitidy typu C Obalený +ss. RNA virus Obsahuje jediný gen kódující polyprotein Vysoká heterogenita Onemocnění – hepatitida, hepatocelulární karcinom, jaterní cirhóza • Léčba – interferon alfa, ribavirin • •

Diagnostika HCV • Založena na průkazu protilátek anti-HCV sérologickými metodami: ELISA, EIA, RIBA • Průkaz RNA metodou reverzně transkripční PCR (kvalitativně-genotypizace a kvantitativně)

Diferenciální diagnostika v klinické mikrobiologii (Josef Scharfen, ml. )

HCV PCR • Klinický materiál – plazma, sérum • Kvalitativní stanovení HCV - genotypizace je přínosná pro optimalizaci terapie, její délky a při odhadu účinnosti léčby • Kvantitativní stanovení-u pacientů s antivirovou léčbou • cíl detekce: konzervativní úsek 5´UTR sekvence

Kvantitativní stanovení HCV ODPOVĚĎ V PRŮBĚHU TERAPIE • rychlá virologická odpověď (RVR) – HCV RNA < 50 IU/ml ve 4. týdnu terapie • parciální časná virologická odpověď (p. EVR) – HCV RNA ve 4. i 12. týdnu terapie je >50 IU/ml, avšak s poklesem nejméně o 2 log 10 oproti výchozí virémii • kompletní časná virologická odpověď (c. EVR) – HCV RNA ve 4. týdnu > 50 IU/ml, ve 12. týdnu negativní • rezistence na léčbu (non response, NR) – hladina HCV RNA se sníží ve 12. týdnu o méně než 2 log 10 oproti výchozí hodnotě

Odpověď na léčbu HCV Vitouš, A. , Virová hepatitida typu C, diagnostika, terapie, prevence. Interní Med. 2010; 12(6): 339– 342

Screening • Dárci při transplantacích jsou plošně vyšetřováni na HCV • Díky tomu došlo k snížení přenosu HCV z 5 % na 0 % • Pooling – úspora peněz

Papilomaviry • Malé neobalené ds. DNA viry (55 nm) • Druhová i tkáňová specificita (kožní a slizniční) • DNA kóduje 8 proteinů časné fáze (E 1 -E 8) a 2 proteiny pozdní fáze • Asi 100 genotypů (více než 30 infikuje genitální trakt) • Podle onkogenního potenciálu se dělí na high-risk a lowrisk rizikové typy HPV • Nejčastěji vyskytující se typ, který přispívá ke vzniku karcinomu děložního čípku, je HPV 16 a HPV 18 • Onemocnění – bradavice, karcinom vulvy, vaginy, penisu, anální karcinom • Léčba – operace, Isoprinosine

Papilomaviry • High risk HPV jsou schopny iniciovat neoplastickou transformaci buněk • Dochází k začlenění virového genomu do DNA hostitelské buňky a produkci onkoproteinů E 6 a E 7 • Vazba proteinu E 6 na p 53 označí p 53 pro degradaci via ubiqitin a tím způsobí ztrátu kontroly buněčné proliferace a destabilizaci genomu

Diagnostika HPV • Klinický materiál: stěry • Morfologické metody (cytologie, histologie) umožňují zjistit subklinickou formu infekce. Histologie klasifikuje změny v bioptickém materiálu a je definitivním potvrzením diagnózy. • Hybrid capture II system (Digine)-hybridizace DNA HPV spolu s typově specifickými RNA sondami • Detekce DNA pomocí PCR – až 95 % a více pravděpodobnost včasného záchytu karcinomu cervixu (oproti 70% v případě použití pouze cytologie)

Vakcinace HPV • Plošná vakcinace proti HPV např. v Austrálii (dívky i chlapci) • Silgard – vakcinace proti HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18 • Cervarix – vakcinace proti HPV 16 a HPV 18 • Zkřížená ochrana proti HPV 31, 33 a 45

Houby

Aspergillus spp. • Vláknitá, kosmopolitní všudypřítomná plíseň • Houbové infekční onemocnění – invazivní aspergilóza u imunokompromitovaných pacientů • Diagnostika: stanovení přítomnosti galaktomananu (ELISA), mikroskopie, kultivace, RTG plic • PCR – 18 S r. DNA, mt. DNA

Antibiotická rezistence

Antibiotická rezistence Přirozená (primární) Získaná (sekunádrní) • Vrozená necitlivost bakteri k • Genetická modifikace genu danému antibiotiku na chromozomu • Důvodem je absence cíle • Převzetím genetického antimikrobiální látky materiálu od jiných mikroorganismů (plasmidy, transpozony, aj. )

Antibiotická rezistence • Akademická půda a referenční laboratoře • Diagnostické laboratoře ve velkých nemocnicích • Nový nástroj pro detekci bakteriální rezistence

MRSA • Rezistence k methicilinu • Stafylokoková chromozomová kazeta (SCCmec) – v současné době 11 typů • Gen mec. A a mec. C • Pozměněný PBP 2 protein (penicilin-binding protein)

MRSA PCR Kity • Molekulární diagnostika – kolonizace MRSA na nosní sliznici • RIDA GENE MRSA (r-biopharm) • Microbial DNA q. PCR Multi-Assay Kit MRSA (Qiagen) • Light. Cycler MRSA Advanced test (Roche)

VRE • Rezistence k vankomycinu u E. faecalis a E. faecium • Geny van. A, van. B – van. G (7 typů rezistencí) • transpozon

VRE • Molekulární diagnostika – rektální stěry pro screening VRE u hematoonkologických pacientů • Seeplex VRE detection Kit (Seegene) • Light. Cycler VRE research use only detection kit

ESBL • Extended spectrum beta-lactamases • Enterobacteriaceae – K. pneumoniae, E. coli • rezistence k penicilinům, cefalosporinům všech generací a monobaktamům • TEM, SHV, CTX-M, OXA • plazmid

Genetika beta-laktamáz typu SHV a CTX-M SHV CTX-M – SHV-1 GGC SHV-ESBL G/A CTX-M + AGC

ESBL • Molekulární diagnostika – konfirmační testy z ESBL pozitivních kultur, rychlé testy u pacientů v ohrožení života • Hyplex ESBL ID (amplex) • Check – direct ESBL (Check points)

Karbapenemázy a metalo-β-laktamázy • Serinová karbapenemáza typu KPC • Metalo-β-laktamázy typu NDM-1, VIM, IMP (první v Česku v roce 2008) • OXA-48 • Amp. C • Plazmidy, transpozony, • integrony

Karbapenemázy a metalo-β-laktamázy • Molekulární diagnostika – verifikace kultivace, test přímo z relevantního klinického materiálu • Amplisens MDR PCR Kit (Amplisens) • Check-MDR Carba (Check-points) • Hyplex Super. Bug ID (amplex)

Multirezistentní M. tuberculosis • Isoniasid, rifampicin, streptomycin, pyrazinamid, ethambutol • Rezistence k isoniasidu – mutace v genu Kat. G isoniasidu (gen pro kataláz-peroxidázu) • Rezistence k rifampicinu – mutace v genu rpo. B rifampicinu (kóduje β pojednotku RNA polymerázy)

M. tuberculosis • Molekulární diagnostika – u mimoplicních forem, u forem s atypickým průběhem (u dětí, HIV+) • V současné době už se plošně neočkuje • Kalmetizační centra • Tuberculosis Drug Resistance Detection Array Kit (Capital. Bio corporation) • Xpert® MTB/RIF (Cepheid)

Shrnutí molekulární detekce antibiotické rezistence • Detekce pouze genotypu ne fenotypu • Detekce pouze částečného genu • Gen se nemusí exprimovat • Mutace v genech pro rezistenci • Lokální prevalence • Rychlé nasazení adekvátní antibiotické terapie • Schopnost sledování epidemiologie Léčba nemůže být založena pouze na výsledku z molekulárně biologických metod

Molekulární diagnostika Fenotypové a sérologické metody Vyléčený pacient