Diagnostica microbiologica Diagnosi diretta e diagnosi indiretta La

Diagnostica microbiologica

Diagnosi diretta e diagnosi indiretta • La diagnosi diretta è rivolta alla ricerca dell’agente infettante o di suoi componenti chiaramente identificati; • La diagnosi indiretta o sierologica sfrutta a fini diagnostici la risposta immunitaria dell’organismo infettato; • Entrambe possono essere qualitative e quantitative.

Diagnosi diretta Diagnosi indiretta • Trova e identifica l’agente – isolandolo e identificandolo – dimostrando la presenza di suoi prodotti specifici • tossine • antigeni • acidi nucleici • Cerca le prove di una risposta immunitaria specifica in atto – ricerca di anticorpi § movimento anticorpale § titolo alto § Ig. G /Ig. M, s. Ig. A Ø scelta tra le svariate reazioni atg-acp – valutazione CMI § skin test (Mantoux per tbc) § nuovi test

Diagnosi diretta e diagnosi indiretta v. La diagnosi diretta è da preferire, consente lo studio analitico di un determinato agente eziologico, soprattutto per quanto riguarda i determinanti genetici della virulenza e della resistenza a farmaci chemioterapici. v. La diagnosi diretta è universalmente praticabile, v. La diagnosi indiretta trova indicazione nelle infezioni acute e nella fase acuta (infezione primaria) delle infezioni persistenti

Criteri per l’accettabilità e l’impiego routinario di un test di diagnostica microbiologica ØSpecificità ØSensibilità ØPraticità e rapidità di esecuzione ØCosto contenuto

Materiali patologici § Essenziale per la diagnosi è che i campioni che raggiungono il laboratorio siano ben scelti e di buona qualità. § I campioni prelevati per la diagnosi batteriologica possono provenire da zone che sono solitamente sterili oppure da zone che possiedono una popolazione microbica residente (Tabella 1).

Zone normalmente sterili

Zone con popolazione batterica residente

Differenti tipi di prelievo

Diversi tipi di campione 1) Proveniente da organi o tessuti prelevati direttamente mediante ago aspirato 2) Prelevati in maniera indiretta per cui esiste una possibilità più o meno indiretta di contaminazione 3) Provenienti da zone con popolazione batterica residente • La qualità del campione è estremamente importante per l’interpretazione dei risultati

Valutazione del risultato • La presenza di un microrganismo deve essere presa in seria considerazione solo se isolato da una zona sterile • Solo se l’isolamento ed il trasporto sono stati eseguiti in modo corretto • Il campione proveniente da zone con popolazione residente la valutazione sarà più difficile ed è necessario ricercare patogeni che riguardano la patologia specifica come uno Streptococcus emolitico in caso di faringite o un batterio enteropatogeno in caso di gastroenterite • Esistono poi campioni che non possono fornire nessuna indicazione e quindi inutili ai fini diagnostici

Raccolta di campioni per la ricerca di batteri patogeni

Raccolta e trasporto

Informazioni • Necessarie da inviare con il campione 1. Nome del paziente 2. Età e sesso 3. Provenienza anatomica del campione 4. Data ed ora del campione raccolto 5. Diagnosi clinica presuntiva 6. Eventuale trattamento antibiotico

TRASPORTO NON DEVE CAUSARE ALTERAZIONI QUALITATIVE E QUANTITATIVE DEL CAMPIONE PER I CAMPIONI CLASSICI SONO DISPONIBILI SISTEMI STANDARDIZZATI DI TRASPORTO, PER ALCUNI CAMPIONI PARTICOLARI SI DEVE PROCEDERE AD IDENTIFICARE UNA PROCEDURA DI TRASPORTO SPECIFICA E RIPETIBILE

Tempi di processazione • I campioni urgenti devono essere processati subito • Gli altri campioni possono essere conservati a 4 -6 °C, per 2 -3 ore senza avere danni particolari. • Ad eccezione di Nesseria gonorrhoeae e Bordetella pertussis labili in ambiente extracorporeo

Metodi di ricerca dei batteri A: utile per la diagnosi, B: utile per la diagnosi di forme specifich e di malattia, C: test non utilizzato nei laborator i di routine, D: test non utile

A: utile per la diagnosi, B: utile per la diagnosi di forme specifiche di malattia, C: test non utilizzato nei laboratori di routine, D: test non utile

Metodi diagnostici • Esame microscopico diretto • solo alcuni elminti possono essere visti ad occhio nudo , batteri, funghi e protozoi, aggregati virali mediante colorazioni. Più sensibile se si utilizza un marcatore fluorescente, anticorpo specifico legante un colorante fluorescente • Le particelle virali possono essere osservate solo al microscopio elettronico

Metodi diagnostici • Coltura: • è possibile la coltivazione in terreni di coltura di molti batteri, quelli intracellulari obbligati come Clamidie, Rickettsiae e virus devono crescere in colture di cellule eucariotiche. • Alcuni non possono essere coltivati in vitro come Treponema pallidum-

Metodi diagnostici • Rilevazione di macromolecole: • utilizzo di tecniche immunologiche permette di rilevare componenti proteiche o polisaccaridiche dei microrganismi. I prodotti metabolici possono essere rilevati mediante gas cromatografia mentre le sonde genetiche permettono l’individuazione di sequenze di acidi nucleici nei vari materiali

Metodi diagnostici • Ricerca anticorpale (diagnosi sierologica): ricerca e quantizzazione di anticorpi specifici prodotti in risposta ad una infezione, possono dare indicazioni di una presenza o pregressa infezione di uno specifico agente infettivo

Diagnosi delle infezioni batteriche Esame microscopico diretto e coltura

Esame microscopico diretto in campo oscuro Treponema pallidum Alcuni batteri particolarmente sottili possono essere osservati al microscopio ottico mediante degli accorgimenti particolari come il campo oscuro , in cui un condensatore focalizza solo la luce diagonale sul campione , mentre all’osservatore arriva la luce riflessa dalle strutture presenti nel preparato. I microrganismi risultano circondati da un alone luminoso su sfondo scuro

Microscopia a contrasto di fase Altra metodica per la visualizzazione di preparati in questo caso le differenze di rifrazione nei campioni sono convertite in differenze dell’intensità della luce nell’immagine , permettendo una migliore visualizzazione nei campioni non colorati , viene usata per osservare funghi o parassiti

COLORAZIONE DI GRAM Safranina Violetto di genziana Soluzione Lugol FISSARE Prelievo e dispersione del campione CONTRASTO Decolorazione Fucsina

Colorazione di Gram • Per una colorazione positiva è necessario: 1. L’integrità della parete 2. Non utilizzare colture batteriche troppo vecchie batteri potrebbero essere morti 3. Batteri danneggiati dal trattamento con l’antibiotico

Colorazione di Gram su campione clinico • I batteri saranno colorati di viola o di rosso • Il materiale presente come leucociti PMN e frammenti cellulari risulteranno colorati in rosso • Se viola il preparato non è stato decolorato bene • In presenza di pus è più facile individuare i batteri

COLORAZIONE PER ALCOOLACIDO RESISTENTI • BATTERI ALCOOLACIDO RESISTENTI TRATTENGONO FUCSINA FENICATA (= FUCSINA BASICA SCIOLTA IN ACQUA, ALCOOL E FENOLO) ANCHE DOPO DECOLORAZIONE CON ACIDO CLORIDRICO DILUITO IN ALCOOL

TERRENI DI COLTURA • GENERALI – NUTRIENT AGAR, TRYPTIC SOY AGAR, MUELLER HINTON AGAR, BRAIN HEART INFUSION AGAR ETC. • DIFFERENZIALI (SPESSO ANCHE SELETTIVI) – AGAR SANGUE, Mc. CONKEY AGAR, MANNITOL SALT AGAR, HEKTOEN ENTERIC AGAR ETC. • SELETTIVI (SPESSO ANCHE DIFFERENZIALI) – Mc. CONKEY AGAR, MANNITOL SALT AGAR, HEKTOEN ENTERIC AGAR ETC, SS AGAR, ENTEROCOCCOSEL AGAR.

Condizioni colturali

INCUBAZIONE • AEROBIOSI GENERALMENTE PRESENTI TRE DIVERSI INCUBATORI A 30°C, 37°C, 42°C • ANAEROBIOSI ATMOSFERA DI INCUBAZIONE 80% AZOTO 10% IDROGENO 10% ANIDRIDE CARBONICA SALVO DIVERSE RICHIESTE SPECIFICHE (CAPNOFILI, MICROAEROFILI, ED ALCUNI ANAEROBI PARTICOLARI)

IDENTIFICAZIONE • FENOTIPICA • MORFOLOGICA • BIOCHIMICA Pseudomonas aeruginosa Clostridium difficile

IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA • • ATTRAVERSO L’IMPIEGO DI SISTEMI AUTOMATICI O SEMIAUTOMATICI, O CON L’ESECUZIONE DI SAGGI BIOCHIMICI MANUALI IN CONDIZIONI STANDARD SI OTTIENE L’IDENTIFICAZIONE SULLA BASE DI UN DATABASE STATISTICO DI CARATTERISTICHE FENOTIPICHE PECULIARI DELLE SPECIE. DIFFERENTI TIPI DI TEST VENGONO ESEGUITI PER DIFFERENTI GRUPPI DI MICROORGANISMI

Batteri Gram negativi

Raccolta dei campioni e procedure diagnostiche per infezioni fungine

Raccolta dei campioni e procedure diagnostiche per infezioni fungine

Colorazione specifiche per individuare i funghi

Colorazioni Gimsa Histoplasma capsulatum Colorazione con argento cisti di Pneumocisti jirovecii

Colorazioni Bianco calcofluor lieviti e pseudoife di Candida albicans Colorazione di Gram ife negative Aspergillus

SAGGI ANTIBIOTICORESISTENZA • ANTIBIOGRAMMA – CONSENTE LA DETERMINAZIONE DI UN PROFILO DI SUSCETTIBILITA’ ESPRESSO COME SENSIBILE, INTERMEDIO, RESISTENTE – OTTENUTO ANCHE CON SISTEMI AUTOMATICI ATTRAVERSO SAGGI IN LIQUIDO SU POCHE DILUIZIONI • DETERMINAZIONE MIC ED MBC – SI OTTENGONO I VALORI PRECISI DELLE CONCENTRAZIONI DI CIASCUN ANTIBIOTICO CHE INIBISCONO E/O UCCIDONO UN SINGOLO CEPPO

SAGGI ANTIBIOTICORESISTENZA • ANTIBIOGRAMMA • MIC

ANTIBIOGRAMMA 3 -4 COLONIE IN BRODO 37°C 0, 5 Mc. Farland 2 -3 h 0, 1 ml spatolati 37°C 18 h LETTURA ALONI DI INIBIZIONE ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

DETERMINAZIONE MIC ED MBC IN LIQUIDO 3 -4 COLONIE IN BRODO 37°C 0, 5 Mc. Farland 24 h MIC 37°C 48 h 0, 1 volumi MBC Diluizioni scalari antibiotico 37°C 48 h

Campioni per la diagnosi virale

Campioni per la diagnosi virale

Diagnosi delle infezioni virali Esame diretto e coltura

Esame diretto e coltura • L’esame al microscopio elettronico non è mai utilizzato per la diagnostica virale per la necessità di personale altamente specializzato • L’esame colturale dipende dal tipo di materiale patologico che viene prelevato e necessitano di linee cellulari generalmente immortalizzate

Materiale patologico • Il materiale patologico deve essere messo in soluzioni tamponate ed inviato al laboratorio considerando che : • Alcuni virus si inattivano dopo 1 -2 ore • Alcuni virus possono essere inattivati dal cotone del tampone • Il terreno di trasporto è una soluzione tamponata con 5% di siero bovino fetale ed antibiotici per evitare contaminazioni batteriche • Per i campioni di urina il terreno deve contenere 35% di sorbitolo • Per i campioni provenienti da escrezioni del naso faringe devono contenere triptosio

Isolamento virale • L’isolamento si esegue su colture di cellule possono essere: • Cellule primarie provenienti da organi e tessuti dopo trattamento con enzimi proteolitici hanno vita breve • Cellule di origine fibroblastica più longeve • Cellule di tessuto neoplastico immortalizzate con vita illimitata più facili da coltivare ma meno sensibili all’infezione dei virus

Terreni per la coltivazione di cellule • Sono costituiti da soluzioni isotoniche bilanciate di Sali contenenti: • aminoacidi, • acidi grassi, • carboidrati • vitamine • Tamponate a p. H 7, 2 con bicarbonato • Incubate a 32 -37°C

Identificazione dei virus isolati • L’effetto citopatico può essere sufficiente anche in considerazione del tipo di cellule in cui replica • Alcuni virus possono produrre agglutinine sulla superficie della membrana delle cellule infette che possono essere messe in evidenza mediante adsorbimento • Individuazione di antigeni virali mediante saggi immunologici

Effetto citopatico

Effetto citopatico • Caratterizzato da : arrotondamento delle cellule con distruzione del citoscheletro • Formazione di sincizi • Arrotondamento ed aggregazione delle cellule in grappoli • Formazioni di inclusioni apprezzabili al microscopio ottico dopo colorazione

Emoagglutinazione

Caratteri antigenici Possono essere studiati mediante l’uso di anticorpi monoclonali o policlonali mediante: • Precipitazione • Agglutinazione • Marcatura enzimatica (enzyme immune assay EIA), fluorescente (IFA), chemiluminescente (CLIA), radioisotopica (RIA)

Rilevazione di macromolecole microbiche • La maggior parte delle metodiche usate sono basate su reazioni immunologiche definite anche come reazioni sierologiche a rovescio. Si utilizzano anticorpi specifici per legare antigeni microbici. • Test di agglutinazione al lattice • ELISA • Immunofluorescenza

Reazioni di agglutinazione E’ necessario un antigene particolato non troppo grande ma neanche troppo piccolo, l’antigene può essere 1) sulla superficie del microrganismo , 2) legato sulla superfiche dell’eritrocita o su particelle di lattice , 3) coagglutinazione quando l’anticorpo si lega con FC alla proteina A di Stafiloccosus aureus e con il FAB all’antigene

Test di agglutinazione al lattice (AL) • Gli antigeni polisaccaridici sono in grado di legare particelle di lattice ricoperte di anticorpi specifici • Utilizzato per la ricerca per esempio del materiale capsulare di alcuni microrganismi come meningococco, pneumococco, ect • Permettendo così una diagnosi precoce

ELISA (Enzyme lynked immunoassorbent Assay) • Nella forma più semplice è la capacità di un anticorpo specifici a cui sono legati enzimi cromogeni in grado di legare un antigene.

Immunofluorescenza • Esame diretto per la ricerca di microrganismi eseguito con anticorpi specifici marcati con fluoresceina. • La fluorescina quando eccitata dalla luce di una certa lunghezza d’onda emette una luce maggiore di colore differente

Immunofluorescenza

Immunofluorescenza • Metodica utilizzata per la ricerca diretta di: • Bordetella pertussis negli strisci nasofaringei • Legionella nei campioni di escreato o di lavaggio bronco-alvelare • Nesseria gonorrhoeae negli strisci uretrali • Chlamydia trachomatis • Possibile anche false reazioni positive in caso di recettori Fc responsabili del legame con l’anticorpo

Diagnosi sierologica di infezione Misurano la risposta anticorpale sierica del paziente in seguito ad un’infezione

Test che saggiano una funzione biologica degli anticorpi • Test sierologici più vecchi misurano gli anticorpi valutando la loro funzione in presenza dell’anticorpo. • Per esempio l’aggiunta di siero di un paziente su microrganismi inattivati può provocare un’agglutinazione al lattice o una emoagglutinazione • La reazione di fissazione del complemento rivela la capacità del siero di attivare la cascata del complemento in presenza dell’antigene o di inibire un’altra attività biologica come per l‘inibizione dell’agglutinazione delle emazie

Reazione di fissazione del complemento Rivela la capacità di un siero di attivare la cascata del complemento in presenza di un antigene

Test che evidenziano gli anticorpi in fase liquida

EIA-ELISA SATURAZIONE IN ALCUNI TEST IMMOBILIZZAZ LAVAGGIO CON POZZETTO AGGIUNTA PER RICERCA DI IONE SOLUZIONE CON SOLUZIONE SIERO LAVAGGIO CONIUGATO ANTIGENI DILUITO ANTIGENE DETERGENTE CONCENTRATA DILUITO AGGIUNTA SUBSTRATO IN SATURANTE NORMALMENTE IN SATURANTE VIENEDI IMMOBILIZZATO TAMPONATA PROTEINE IN SOLUZIONE E SVILUPPO DELLA UN ANTICORPO SPECIFICO ALCALINA PER ALLONTANARE NON REATTIVE REAZIONE ANTIGENE NON (es. ALBUMINA) LEGATO

Ricerca di anticorpi in fase solida immunofluorescenza indiretta

SENSIBILITA’ DEI SAGGI IMMUNODIAGNOSTICI SAGGIO SENSIBILITA’ (µg Ab/ml) PRECIPITAZIONE AGGLUTINAZIONE (diretta) AGGLUTINAZIONE (passiva) RIA* EIA-ELISA * IMMUNOFLUORESCENZA 24 -160 0, 4 0, 08 0, 0008 -0, 008 8, 0 *ELEVATA RIPRODUCIBILITA’ INTERTEST ED INTRATEST, POICHE’ ESEGUITI DA SISTEMI AD ELEVATA AUTOMAZIONE