Diagnostic biologiques Du dpistage au suivi de linfection

Diagnostic biologiques Du dépistage au suivi de l’infection 18 juin 2013 Dr NDAYIKUNDA Claudette

DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 OBJECTIF • Connaître les différents tests biologiques utilisés pour le dépistage du VIH • Savoir interpréter le résultat d’un test de dépistage du VIH • Connaître les différents tests biologiques utilisés pour le suivi d’un patient infecté par la VIH • Savoir proposer les tests biologiques appropriés à la situation clinique DIU de la région des grands lacs P 5 S 1 juin 2010 - Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux

Comment détecter le virus ? • En cherchant des traces directes du virus – Virus entier • Culture cellulaire – Particules liés au virus • Antigène – Antigénémie P 24 • Génome viral – Charge virale VIH • En cherchant des traces indirectes du virus – Sérologie

Le dépistage

Les tests « sérologiques » • Sérologie – Détection de particules dans le « sérum » – Antigènes ou anticorps • Quelles méthodes de sérologie – Tests rapides� – Tests « ELISA » – Tests Western Blot

DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Cinétique des marqueurs au cours de l’infection par VIH-1 • Tests utilisés: • • ELISA; Tests rapides L’apparition des anticorps demande un certain délai : fenêtre sérologique: 21 J (6 à 38 j selon les techniques). Pendant cette période, sujet est contagieux mais la sérologie est négative DIU de la région des grands lacs P 5 S 1 juin 2010 - Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux

Technique ELISA • ELISA: Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay • Principe du test – Mise en évidence d’anticorps présents dans un sérum par la visualisation d’une réaction colorée

DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Tests de 4ème génération DIU de la région des grands lacs P 5 S 1 juin 2010 - Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux

DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Test ELISA DIU de la région des grands lacs P 5 S 1 juin 2010 - Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux

Tests rapides • Principe proche de l’ELISA • Permetde faire le dépistage d’anticorps anti-VIH en moins de 30 minutes par simple lecture visuelle • Sensibilité comparable à celle des ELISA

Méthode immunofiltration

Test Rapide Détermine • Le Test Rapide Détermine est un test Immunochromatographique

Tests Rapides pour la détection d’anticorps anti-VIH • Determine • Oraquik* • Unigold* • Multispot* • Stat-pak • Hemastrip • SUDS* • Capillus *Apprové par la FDA • • Abbot Laboratories Ora. Sure Trinity Biotech Chembio Diagnostic Systems SDS Abbott Laboratories Trinity Biotech

Test de confirmation (Western Blot) • Met en évidence les anticorps anti-VIH 1 ou VIH 2, spécifiques différentes protéines virales. • Avantages et utilisation – Test spécifique – Permet de trancher s’il y a une discordance avec les autres tests – Dans certains pays : utilisé comme test de confirmation si l’ELISA est positif

Western Blot

DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Diagnostic sérologique de l'infection par le VIH Tests ELISA § Très bonne sensibilité ; spécificité > 99 % § Temps de réalisation = 2 -3 heures Test de Western Blot = CONFIRMATION si nécessaire VIH-1 VIH-2 gp 160 gp 110 68 55 gp 140 gp 105 68 56 gp 41 40 § Positivité du test si présence d'au moins 3 anticorps dont au moins 2 anticorps anti-enveloppe § Pratiqué si test(s) ELISA positif(s) § Moins sensible, plus spécifique DIU de la région des grands lacs P 5 S 1 juin 2010 - Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux 34 25 gp 36 26 18 16

DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Organisation du génome du VIH Why mucosal vaccination Glycoprotéines de l’enveloppe gp 41 gp 120 env gag pol RU 5 17 MA vif vpr p 24 CA p 7 NC Protéines internes protéase RT intégrase Enzymes virales nef UR 3 vpu tat rev Protéines virales régulatrices DIU de la région des grands lacs P 5 S 1 juin 2010 - Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux

DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Critères d’interprétation du Western Blot • 2) Western –blot positif: varie selon les institutions DIU de la région des grands lacs P 5 S 1 juin 2010 - Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux

DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Critères d’interprétation du Western Blot • 1) Western –blot négatif: absence de bandes DIU de la région des grands lacs P 5 S 1 juin 2010 - Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux

DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Critères d’interprétation du Western Blot • 3) Western blot INDETERMINE : ni positif, ni négatif DIU de la région des grands lacs P 5 S 1 juin 2010 - Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux

DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Critères d’interprétation du Western Blot • En cas de Western blot INDETERMINE • il faut recher : – Une séroconversion (ag p 24) – Une infection par le VIH-2 – Une infection par un variant VIH-1 – Une reactivité non spécifique DIU de la région des grands lacs P 5 S 1 juin 2010 - Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux

Avantages et inconvénients des tests utilisés • Tests rapides – Avantages • Remise « immédiate » du résultat • Sensibilité et spécificité comparable à celle des ELISA – Inconvénients • Pas adapté au traitement de grands nombres d’échantillons • ELISA – Avantages • Permet l’analyse de grands volumes de spécimens – Inconvénients • • Matériel sophistiqué Personnel qualifié Entretien du matériel Source continue d’énergie électrique

Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • • Décompte des lymphocytes T (CD 4) Charge virale Hémogramme Chimie sanguine Examen parasitologique des selles Examen de crachats Sérologies pour les pathologies associées – Toxoplasmose – Syphilis – Cytomegalovirus

Décompte des CD 4 • Pourquoi compter les CD 4 ? – Leur niveau est corrélé au fonctionnement du système immunitaire – Indicateur d’initiation du traitement ARV

Interprétation de la mesure des CD 4 • Valeurs normales : 1000/mm 3 • Infections opportunistes mineures : CD 4 entre 350 et 200/mm 3 • Infections opportunistes majeures (SIDA) – CD 4 < 200/mm 3 • %CD 4, rapport CD 4/CD 8 – pas d’intérêt (sauf enfants) • Possibles valeurs aberrantes – Infection aiguë – Problèmes techniques

Evolution des CD 4 sous traitement • La remontée des CD 4 est imprévisible – Vitesse de remontée ? – Niveau atteint sous traitement ? • Niveau de départ important +++ – Plus on part de bas, moins cela remontera haut… • Les CD 4 continuent à augmenter plusieurs années après la mise sous traitement

Méthodes de décompte des CD 4+ • Méthode manuelle de décompte : Cyto Sphères (COULTER ) – Très long… • Méthode automatisée de décompte: cytométrie de flux – Permet de traiter un très grand bombre d’échantillon – Très exigeant – Nécessite appareil de mesure, réactifs particuliers, « consommables » particuliers… • Très peu de pays en développement arrivent à faire fonctionner la technique… • Nouvelles méthodes – Appareils portatifs, système à « cassette » , un échantillon/20 minutes

Décompte manuel (Coulter)

Cytométrie de Flux

Tests de suivi des PVVIH Décompte des lymphocytes T (CD 4) Charge virale Tests diagnostiques de la Syphilis Hémogramme Examen des selles pour la recherche des parasites et des coccidies • Examen des crachats • Test de grossesse • Chimie sanguine/Bilan hépatique • • •

Charge virale (1) • Amplification génique de l’ARN viral • Expression du résultat – En nombre de « copies » de virus par m. L de plasma • Par exemple 145 000 copies/m. L – Parfois exprimé en log 10 de ce chiffre • 145 000 = 5, 16 Log 10 • Technique – Très exigeant – Nécessite appareil pour la charge virale, laboratoire spécial, centrifugeuses, hottes de préparation, réactifs particuliers, « consommables » particuliers, congélateurs à -80°C… • Très peu de pays en développement arrivent à faire fonctionner la technique…

Charge Virale (2) • Intérêt – Avant traitement • Intérêt modéré • Permet d’avoir une idée de la rapidité d’évolution de l’infection – Sous traitement • EXAMEN ESSENTIEL ++++ • Seule méthode biologique fiable d’évaluation de l'efficacité du traitement

Charge virale (3) • Sous traitement – La charge virale diminue très vite – La charge virale doit être indétectable après 6 mois de trithérapie – La charge virale doit rester en permanence indétectable sous traitement • Gage d'efficacité des traitements à long terme

DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 PLASMA LYMPHOCYTES T 4 CIRCULANTS Etats du virus dans la circulation Lympho CD 4 au repos Lympho CD 4 activé Virus latent Virus en réplication PCR ADN VIH Virus libre Antigène p 24 soluble Burgard, V PCR ARN VIH ou Charge virale Complexée à des Ac Libre Apres Dissoc. Ag p 24 36 DIU de la région des grands lacs P 5 S 1 juin 2010 - Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux

Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • • Décompte des lymphocytes T (CD 4) Charge virale Hémogramme Chimie sanguine Examen parasitologique des selles Examen de crachats Sérologies pour les pathologies associées – Toxoplasmose – Syphilis – Cytomegalovirus

Hémogramme • Etude qualitative et quantitative des éléments trouvés dans le sang humain. • Il est important dans l’initiation du traitement et le suivi du patient sous ARV.

Paramètres les plus importants • Numération cellulaire – Décompte des globules blancs – Décompte des globules rouges – Décompte des plaquettes • Hémoglobine • Volume globulaire

Méthodes utilisées • Méthode automatique – Les cellules sanguines sont comptées selon leurs tailles. • Méthode manuelle – Les cellules sanguines sont comptées en utilisant un hématimètre après dilution

Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • • Décompte des lymphocytes T (CD 4) Charge virale Hémogramme Chimie sanguine Examen parasitologique des selles Examen de crachats Sérologies pour les pathologies associées – Toxoplasmose – Syphilis – Cytomegalovirus

Importance de la biochimie • Les tests de la chimie sanguine permettent: – D’évaluer la façon dont le patient pourra tolérer certains traitements – De faire le bilan de certaines « comorbidités » avant traitement • • Hépatite Insuffisance rénale Diabète … – De faire le suivi du patient déjà sous thérapie pour déceler tout effet secondaire cliniquement silencieux

Chimie sanguine • Les tests de la chimie sanguine comportent: – Un bilan hépatique et pancréatique • SGOT, SGPT, Bilirubine, phosphatase alcaline, glycémie (amylase, lipase) – Un bilan rénal • Créatine, urée – Un bilan lipidique • Cholestérol (+ fractions LDL et HDL) • Triglycérides

Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • • Décompte des lymphocytes T (CD 4) Charge virale Hémogramme Chimie sanguine Examen parasitologique des selles Examen de crachats Sérologies pour les pathologies associées – Toxoplasmose – Syphilis – Cytomegalovirus

Techniques et coloration des selles • Techniques – Examen direct – Concentration des selles – Enrichissement des selles • Colorations – Etat frais dilué au sérum physiologique – Colorations diverses en fonction des parasites recherchés

Recherche des leucocytes dans les selles • Coloration au bleu de Méthylène • La présence de beaucoup de polynucléaires peut indiquer une atteinte invasive d’origine bactérienne, alors que les éosinophiles attirent l’attention sur une atteinte parasitaire

Interprétation des résultats Négatif: Absence de parasites ou d’œufs Positif: Présence de parasites ou d’œufs

Recherche de Coccidies • Méthode de coloration de Ziehl Nielsen modifiée • Les principales coccidies sont: – Cryptosporidium – Cyclospora – Isospora belli

Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • • Décompte des lymphocytes T (CD 4) Charge virale Hémogramme Chimie sanguine Examen parasitologique des selles Examen de crachats Sérologies pour les pathologies associées – Toxoplasmose – Syphilis – Cytomegalovirus

Analyse des crachats = recherche de tuberculose • La tuberculose est l’infection opportuniste prédominante chez les patients VIH+ • Importance +++ – Du diagnostic en cas de symptômes – Du dépistage en l’absence de symptômes

Recherche des Bacilles Acido Alcoolo Résistants (BAAR) • Coloration de Ziehl Nielsen – Étalement des crachats – Faire sécher le frottis à l’air libre – Fixer le frottis – Colorer (Ziehl Nielsen)

Lecture au microscope • Ces bacilles peuvent être retrouvés dans les spécimens suivants: – – – Crachats Sang Selles Urines Tissus • A l’examen direct – Présence de bacilles acidoalcoolo résistants (BAAR)

Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • • Décompte des lymphocytes T (CD 4) Charge virale Hémogramme Chimie sanguine Examen parasitologique des selles Examen de crachat Sérologies pour les pathologies associées – Toxoplasmose – Syphilis – Cytomegalovirus

DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Cas clinique 1 • Espérance, 28 ans, vient consulter parce qu’elle tousse depuis trois mois, elle a perdu 10 kg • Son mari est mort l’année d’avant, on lui a dit que c’était le SIDA. • Elle a un enfant qui a 2 ans, et il est malade du SIDA, il prend un traitement ARV • Espérance a fait un test de dépistage du VIH, dans un laboratoire en ville, et elle amène le résultat qui est négatif Que dites-vous à Espérance ? Que faites-vous ? DIU de la région des grands lacs P 5 S 1 juin 2010 - Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux

DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 F 1 CLASSIFICATION DU VIH-1 F 2 K Groupes M, N, O Sous-types A, B, C, D, F, G, H, J, K Sous-sous-types A- A 2, F 1 - F 2, B- D formes Recombinantes Circulantes (CRFs) CRF 01 à CRF 37 B D C Groupe M H A CRF 02 -AG CRF 01 -AE G J SIVcpz. US (Recombinants Uniques ) Groupe N SIVCPZGAB Groupe O SIVCPZANT 0. 1 DIU de la région des grands lacs P 5 S 1 juin 2010 - Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux

DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Cas clinique 2 • Deogratias, 22 ans, a eu un test de dépistage qui est positif pour le VIH. Il a quelques ganglions sous les aisselles, et son ancienne partenaire était séropositive pour le VIH, ce qui a motivé la réalisation du dépistage. • Que proposez-vous à Déo pour les examens complémentaires biologiques ? DIU de la région des grands lacs P 5 S 1 juin 2010 - Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux

DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Cas clinique 3 • Sidonie, 40 ans, est sous traitement ARV par Duovir-N depuis 1 an. Elle avait perdu 20 kg avant le début du traitement, qu’elle a presque intégralement repris. Les CD 4 avant traitements étaient à 110/mm 3 • Elle tolère bien son traitement, les CD 4 sont remontés à 220/mm 3 • La charge virale est à 15 000 copies/ml Quelle est la signification de ce résultat ? Que proposer à Sidonie ? DIU de la région des grands lacs P 5 S 1 juin 2010 - Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux

Points à retenir • Le dépistage du VIH dans la région des grands lacs repose essentiellement sur les TESTS RAPIDES • Pour la décision de mise sous traitement, on utilise la numération des lymphocytes CD 4 • Pour le suivi de l’efficacité du traitement antiviral, le meilleur examen est la mesure de la charge virale VIH

Points à retenir (suite) • Le laboratoire va amener une aide importante pour le suivi de la toxicité des traitements – Hémogramme – Chimie sanguine • Le laboratoire va amener une aide importante pour le diagnostic des complications du VIH, notamment les infections opportunistes – Tuberculose – Infections parasitaires digestives

C’est fini !