Determinazione della concentrazione di Ig G tramite saggio

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Determinazione della concentrazione di Ig. G tramite saggio immunoenzimatico competitivo COATING Preparare una soluzione

Determinazione della concentrazione di Ig. G tramite saggio immunoenzimatico competitivo COATING Preparare una soluzione di Ig. G di rabbit 1 g/m. L in tampone carbonato 0. 05 M p. H 9. 6 (soluzione A) a partire da una soluzione di un 1 mg/m. L. Addizionare 200 L della soluzione A in ciascun pozzetto e lasciare incubare per 1 h a temperatura ambiente (RT); 3 lavaggi con 200 L di PBS + TWEEN 0. 05%. BLOCCAGGIO Preparare 5 ml di BSA 5% in carbonato (preparare nelle falcon tappo blu) Addizionare nei pozzetti 200 L di una soluzione al 5% di BSA in PBS (1 h RT); 3 lavaggi con 200 L di PBS + TWEEN 0. 05%. COMPETIZIONE Preparare, per diluizioni successive, 1 ml di 5 soluzioni standard di Ig. G (in PBS): 100, 1, 0. 01 g/m. L. Preparare 5 m. L di una soluzione di Mab-AP 1: 1000 (v/v). Successivamente, preparare 10 m. L di una soluzione 1: 10000 (v/v) per diluizione 1: 10 (v/v) della soluzione di Mab-AP precedente. Secondo lo schema riportato in figura, addizionare in ogni pozzetto 100 L di Ig. G di rabbit alle concentrazioni sopra indicate e 100 L di MAb-AP (1: 10000 in PBS). Porre nei pozzetti 7 A, 7 B, 7 C, al posto dello standard, 100 L del campione incognito. * nei 3 pozzetti (1 A, 1 B, 1 C) di non competizione porre 100 L di MAb-AP + 125 L di PBS. Incubare 1 h a RT. 3 lavaggi con 200 L di PBS + TWEEN 0. 05%.

0* 1 0. 01 0. 1 1 10 100 ? 0* 2 3 4

0* 1 0. 01 0. 1 1 10 100 ? 0* 2 3 4 5 6 7 1 0. 01 0. 1 1 10 100 ? 2 3 4 5 6 7 A A ? B B ? C C ? LETTURA Porre in ogni pozzetto 200 L di una soluzione di 4 -nitrofenilfosfato (11 m. M) preparata in tampone carbonato Eseguire la lettura della piastra a 405 nm dopo 5, 10, 15 min. ELABORAZIONE DATI Riportare in grafico le assorbanze lette a 405 nm in funzione delle concentrazioni utilizzate; dalla curva ottenuta ricavare la concentrazione del campione incognito.