Deteksjonsmetoder for Prionprotein Immunhistokjemi Western Blot Immunoassay Bioassay

Deteksjonsmetoder for Prionprotein * Immunhistokjemi & Western Blot * Immunoassay * Bioassay * Conformation-dependent immunoassay MNKBi 2014 The molecular basis of mad-cow disease 1

Diagnose av BSE * Makroskopiske undersøkelse av hjernen * Karakteristiske forandringer: vakuoler * Transmisjon elektronmikroskopi: scrapie-assosierte fibriller ( SAFs ), merket med gull partikler * Hurtigtester, støttemetoder A. Pr. Pc B. Pr. Pc og/eller Pr. Psc C. Fibriller av Pr. P 27 -30 MNKBi 2014 The molecular basis of mad-cow disease 2

MNKBi 2014 The molecular basis of mad-cow disease 3

1. Immunhistokjemi * Reaksjon mellom spesifikk antistoff og antigen i vevet * Deteksjonsmarkør MNKBi 2014 The molecular basis of mad-cow disease 4

Western blot med SDS-PAGE * Separering og detektering av protein etter størrelser * Behandles med proteinase K * SDS: denaturering av proteinene * PAGE: separering av proteinfragmentene etter størrelser * Kopierer gelavtrykket på en nitrocellulose membran * Proteinfragmentene visualiseres med spesifikk anti-Prp MNKBi 2014 The molecular basis of mad-cow disease 5

2. Immunoassay * Samme prinsipp som Western blotting * ELISA: Plastikk plate med brønner * Sandwich teknikk ( indirekte merking ) MNKBi 2014 The molecular basis of mad-cow disease 6

ELISA - sandwich teknikk MNKBi 2014 The molecular basis of mad-cow disease 7

3. Bioassay * Overføring av BSE til dyr * Lang inkubasjonstid * Forlenget inkubasjonstid pga artsbarrieren MNKBi 2014 The molecular basis of mad-cow disease 8

4. Confomation-dependent immunoassay ( CDI ) * En prøve deles I 2 løsninger * Uten behandling, native “N” = Pr. Pc * Denaturering “D” = Pr. Pc+Pr. Psc * D-N = ? * ? Større enn “N” BSE infeksjon MNKBi 2014 The molecular basis of mad-cow disease 9

MNKBi 2014 The molecular basis of mad-cow disease 10

MNKBi 2014 The molecular basis of mad-cow disease 11

Fordeler vs ulemper * Western blot: tidkrevende ( min. 8 timer), mye arbeid * ELISA: hurtigtest (8 timer), massetesting * Bioassay: dyr, lang inkubasjonstid * CDI: sensitiv, hurtigtest (4 timer), massetesting MNKBi 2014 The molecular basis of mad-cow disease 12