Department of Biotechnology Hung Kuang University Taichung Taiwan

生物轉換法生產度洛西汀不對稱中間體之菌株篩選 林宛樺, 梁崑鑫, 詹馨嬅, 李亞儒, * 高肇鴻 Department of Biotechnology, Hung. Kuang University, Taichung, Taiwan Abstract 度洛西汀 (Duloxetine) 化學名為：(+)-(S)-N-Methyl-3 -(naphthalen-1 -yloxy)-3 -(thiophen-2 -yl)propan-1 -amine，俗名：千憂解、商品名：Cymbalta®，是由美國 Eli Lilly 公司開發的腎上腺、血清雙重再回收抑制劑 Serotonin-norepinephrine reuptake inhibitor-(SNRI)，用於治療憂鬱症，憂鬱症已為聯合國世界衛生組織視為新世 紀三大疾病。三大疾病，包括：心血管疾病、憂鬱症與愛滋病。在 2020年，憂鬱症將成為世界第二大疾病。世界衛生組織並統計，全球有3％的人患了憂鬱症，總憂 鬱症人口達 2億人左右。根據統計，台灣地區憂鬱症點盛行率約7. 3%，換言之，目前台灣約一百五十萬人罹患憂鬱症。(S)-Duloxetine ，在 1990年取得專利後，在治 療許多合併症上都已經被證實其療效，此藥物亦被 FAD 批准用於婦女重度尿失禁和成人糖尿病復發與周邊神經痛的治療。並在 2004年至 2010年間取得歐盟、美國 FAD以及各國的核准使用。而在 2013年專利過期之際，各國都希望能開發出一條有競爭力路線，去製造並大量生產學名藥。Duloxetine 為 Fluoxetine (百憂解)的替代 品，化學穩定好、安全性高、副作用少、對神經系統親和力低，在治療憂鬱症方面比目前其他西汀藥物作用更好，且度洛西汀於 2010年的銷售量 348億相較於 2009年 銷售量 307億足足升高了13%，因此本實驗選殖出具表現還原能力的菌株，可將受質 3 -(methoxy(methyl)amino)-1 -(thiophen-2 -yl)propane-1 -one (AMK)經過還原作用 後形成 Duloxetine 的中間體 3 -(methoxy(methyl)amino)-1 -(thiophen-2 -yl)propane-1 -ol (S)-MMAA-OMe，此步驟以 glucose 為碳源並利用 HPLC 進行酵素活性篩選， 現今已經選殖到具有產生 carbonyl reductase 的基因，經誘導產生酵素後可將受質轉換為Duloxetine的中間體。 Europe SUI DPNP Introduction Patent 1990年文獻顯示，度洛西汀包含有一種立體結構，僅有(S)-對映體，具有藥學活性。可經由逆合成 ( 醇的衍生物逆合成分析) 規劃發現，數種 chiral alcohol 可做為 (S)-Duloxetine 的關鍵性藥物中間體。 主要獲得中間體的作法，是透過 resolution-racemization-recycle 將 racemic DHTP，利用大量的 (S)mandelic acid 及經由多步驟去獲得所需的藥物中間體 (S)-DHTP。也可從相對應的 ketones 經由單一步 驟，利用一個有效的不對稱還原反應達到所需的 chiral alcohols。但是，這種典型獲得對映體的方法僅 能達到 ~90% 的對映體當量 (e. e. )，這會阻礙到 業上的應用，此外進行此種方法也會有重金屬汙染的 風險。近年來許多文獻都顯示，以生物還原法 (bioreduction) 所製造出來的光學藥物中間體 (chiral pharmaceutical) 具有實質的貢獻，是因為生物還原法，有良好的化學性、區域和對映選擇性，並具有 高生產力，並在製造的過程中具有環保型的性質。因此本實驗選殖出具表現還原能力的菌株，可將受 質 3 -(methoxy(methyl)amino)-1 -(thiophen-2 -yl)propane-1 -one (AMK) 經過還原作用後形成 Duloxetine 的中間體，未來直接與 1 -氟萘縮合，最後用Li. Al. H 4 或金屬鋅作為還原劑將氮, 氧-裂解得到(S)-度洛西汀。 US approval 2004 GAD Health Canada DPNP 2005 -06 2007 2010 Chronic pain Patent expiration 2013 2008 -11 2008 FM MDD Lilly Reports Full-Year Results 13% 4, 000 3, 480. 7 14% 3, 500 28% 3, 000 2, 500 3, 074. 7 2, 697. 1 2, 102. 9 Millions % Growth 2, 000 1, 500 1, 000 500 0 2007 2008 2009 2010 Microorganisms Strain Methods → 10 ml BHIB or TSB → 55℃, 24 h Table 1 Reaction solution • 10 m. M AMK • 2% Glucose • 0. 1 M Tris-HCl buffer p. H 8. 0 • Cell weight 0. 6 g Duloxetine Process 0. 1% Microorganisms Strain → subculture 100 ml BHIB or TSB → 55℃, 15 h Table 2 Reversed-phase HPLC (S)-MMAA-OMe AMK Wash bacterial cells with • Column: VERCOPAK C 18 (250 mm × 4. 6 mm) • Mobile Phase: 30% acetonitrile • Rate: 1. 0 m. L/min 30 ml Tris-HCl buffer p. H 8. 0 2 ml reaction solution Table 3 Normal-phase HPLC → 37 ℃, 24 h • Column: CHIRALCEL OJ-H column • Mobile Phase: n-Hexane/IPA=97/3, 0. 2 % DEA (diethylamine) • Rate : 1. 2 ml/min Li. Al. H 4 or Zinc metal 0. 22 μm filter → HPLC analysis Scheme 1 Proposed process for Duloxetine synthesis Results AMK (A) S Table 4 生物轉換法生產度洛西汀不對稱中間體之菌株篩選 R Microorganisms column Geobacillus stearothermophilus Strain 10 Geobacillus kaustophilus BCRC 11223 Geobacillus thermoleovorans DSM 5366 T C 18 0. 60 m. M 0. 74 m. M V S >99 51 >99 R 49 - Serratia marcescens subsp. BCRC 10948 V - - Serratia quinivorans BCRC 14811 Bacillus subtilis subsp. Subtilis 168 Geobacillus uzenensis DSM 13551 T Aeribacillus pallidus W 9 A 52 Geobacillus thermodenitrificans DSM 465 T (=L 2 -65) Marinibacillus marinus DSMZ 1297 T Geobacillus stearothermophilus NRRL B-4419 Geobacillus stearothermophilus ATCC 12980 T Geobacillus thermoglucosidasius DSM 2542 T (=KP 1006) Bacillus sp TS-23 C. glutamicum LS 1183 V X V V V X X X - - Corynebacterium glutamicum Ncu 82405 -5 V - - Pseudomonas amyloderamosa V - - AMK Fig. 2 Chiral HPLC 分析 AMK標準品及(±)-MMAA-OMe 標準品 (A) S R (B) (±)-MMAA-OMe (B) Fig. 1 HPLC 分析 標準品及其光譜 (A) AMK 標準品 (B) (±)-MMAA-OMe標準品 AMK S R MMAA-OMe (%) Fig. 3 Chiral HPLC 分析反應液 (A) 反應液中加入 (±)-MMAA-OMe標準品 (B) 反應液 Discussion 成功篩選出Geobacillus stearothermophilus Strain 10 具有將 AMK 轉換成 (±)-MMAA-OMe的能力， 並有催化產物(S)-MMAA-OMe之光學專一性，未來直接與 1 -氟萘縮合，最後用Li. Al. H 4 或金屬鋅作 為還原劑將氮, 氧-裂解得到(S)-度洛西汀，此方法減少化學反應步驟，則將成為一項極具應用價值的 路徑。 References 1. K. B. Thor, M. Kirby, L. Viktrup (2007) Serotonin and noradrenaline involvement in urinary incontinence, depression and pain: scientific basis for overlapping clinical efficacy from a single drug, duloxetine. Int J Clin Pract. 61(8): p. 1349 -55. 2. Soni P, Banerjee UC (2005) Biotransformations for the production of the chiral drug (S)-duloxetine catalyzed by a novel isolate of Candida tropicalis. Appl Microbiol Biotechnol 67: 771– 777 3. Bymaster, F. P. , et al. , Duloxetine (Cymbalta™), a dual inhibitor of serotonin and norepinephrine reuptake. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2003. 13(24): p. 4477 -4480.