DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA TEMA: “DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LOS AGENTES TORCH POR LA TÉCNICA DE PCR EN MUJERES DE ETAPA FÉRTIL DEL CANTÓN QUITO” Elaborado por: Cando Dumancela, Christian Guillermo Directora de Tesis: Ph. D. Jiménez Arias, Ana Patricia Sangolquí, 2018

ÍNDICE INTRODUCCIÓN JUSTIFICACIÓN OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES

Introducción INFECCIONES CONGENITAS Figura 2. - Bradiozitos de Toxoplasma gondii Fuente: Xunji, 2007 Figura 3. - Estructura externa de un Herpesvirus Fuente: Monar, 2008 Tabla 1. Clasificación de las Infecciones congénitas PATOLOGIAS Figura 1. - Patologías congénitas Fuente: Cann, 2006 EDAD GESTACIONAL EFECTO Malformación congénita Primer y Segundo Trimestre Malformación irreversible Lesiones congénitas Segundo Trimestre Lesiones que pueden abarcar pérdida de funciones Infecciones asintomáticas Tercer trimestre Las infecciones se desarrollan después del parto Fuente : Cofre et al. , 2016

Introducción INFECCIONES TORCH T O R C H • TOXOPLASMA Tg Toxoplasma gondii Tabla 2. Patologías relacionadas con TORCH • Epstein Barr VEB • Varicella zoster VVZ • Rubeola virus • Cytomegalovirus CMV • Herpes Simple HSV-1 y HSV-2 Patologias frecuentes Microcefalia Meningitis Hidrocefalia Ictiosis congénita Calcificaciones intracraneales Ceguera congénita Cataratas Malformaciones Cardiomegalia Muerte neonatal Insuficiencia cardiaca congestiva Interrupción del parto Fuente: Cofre et al. , 2016)

Introducción TOXOPLASMA Figura 4. - Toxoplasma gondii Fuente : Cann, 2012 Figura 5. - Ciclo biológico de Toxoplasma gondii Fuente : Centers for Disease Control and Prevention, 2016

Introducción GENOMA Toxoplasma gondii Gen B 1 Figura 6. - Genoma del parásito Toxoplasma gondii Fuente: Vanegas et al. 2006

Introducción PREVALENCIAToxoplasma gondii 48 – 56 % 54% 77% 48 – 65 % 85 - 99% 48 – 76 % 50 – 72 % 64 - 98 % 48 – 63 % Figura 7. - Prevalencia Mundial de Toxoplasma Fuente: Lalama y Tamayo 2014, Mortensen 2015 Lorenzi, 2016, Monsalve , 2016 Sijhal, 2017 68%

Introducción HERPESVIRUS V td IRION EP H S OST HUT OFF PL tc VP 16 IEG Figura 8. - Estructura de Herpesvirus Fuente : Stevensen, et al, 2012 GL Figura 9. - Ciclo reproductivo del Herpesvirus Fuente: Silva 2015

Introducción PREVALENCIA MUNDIAL HERPESVIRUS 92 % 85% 99% 96 % 92% - 97% 93 % HSV-1 67% CMV 50% VVZ 61% Figura 10. - Prevalencia mundial de Herpesvirus Fuente: WHO, 2017, Canepa 2015, Grose 2015, Cofre 2016 CMV 95% HSV-1 74% VVZ 70% 90 - 98 % HSV 1 86% EBV 67% CMV 82% VVZ 87% 98% Figura 11. - Clasificación de los Herpesvirus Fuente: Cann, 2015 87%

Introducción Figura 12: Organización genética de los Herpesvirus. Fuente: (Roizman & Ward, 2015)

JUSTIFICACIÓN

Justificación INFECCIONES CONGÉNITAS CAUSADAS POR TORCH Figura 13. TORCH congénito. Fuente: Sampurna, 2014 TORCH Congénito distribución 8% 27% CENTROS DE REFERENCIA 24% 41% Malformaciones Lesiones leves lesiones graves Muerte Figura 14. Distribución TORCH congénito. (Murray et al. , 2016) Figura 15. Centros de referencia para TORCH en Ecuador.

Justificación DIAGNÓSTICO DE TORCH Diagnóstico Tradicional Métodos Moleculares Diagnóstico Clínico Fuente: MSP 2016 Serología Tinción de Wrigth Tinción Inmunofluorescente ELISA Ig. G, Ig. M Individual PCR Líquido Amniótico Kit Pruebas rápidas • • • Nest PCR Tg (Fuentes 2001) Nest m. PCR EBV, CMV, VVZ (IBM, 2010) RT–PCR CMV (HMES, 2015) PCR Líquido cefalorraquídeo • • Figura 16: Kit de prueba rápidas para TORCH, Fuente: Cromatest 2012) Nest PCR HSV 1 y HSV 2 (IBM, 2008) RT-m. PCR HSV 1 – VVZ 1 (Del Hoyo, 2010)

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL Identificar agentes TORCH por la técnica de Nest-PCR y multiplex PCR en mujeres en etapa fértil del cantón Quito.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS q Establecer un protocolo para la extracción de ADN total a partir de muestras de sangre periférica. q Implementar técnicas de Nest-PCR y multiplex PCR para la identificación molecular de los agentes TORCH. q Identificar la prevalencia de agentes TORCH presentes en las muestras analizadas. q Reconocer las zonas de Quito donde se concentra la mayor cantidad de muestras positivas para los agentes TORCH. q Identificar el grupo de edad con mayor vulnerabilidad para desarrollar infecciones por agentes TORCH.

METODOLOGÍA

Metodología INSTITUCIONES PARTICIPANTES

Metodología CONFORMACION DEL GRUPO DE ESTUDIO A B Figura 17. Distribución parroquial del Cantón Quito Fuente: DMQ, 2017 Figura 18. Distribución del grupo de estudio por A Zonas y B Edades

Metodología PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Recolección y etiquetado Extracción de ADN Electroforesis Cuantificación ADN Resultados Figura 19. Diagrama del proceso para la identificación de los agentes TORCH. PCR

Metodología Extracción de ADN A Figura 20: Extracción de ADN por la técnica de Salting Out A ) Digestión de la muestra B) Extracción de ADN Fuente: Sambrook, J, 2001 B

Metodologia REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Figura 21: Pasos de la Reacción en cadena de la polimerasa PCR. Fuente: Editado de: (Bogetto & Waidne, 2000)

Metodología REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Figura 22. Nest- PCR. Fuente: Editado de: (Hurtado, Aduriz, & Moreno, 2001) Figura 23 Esquema de la Multiplex PCR m. PCR. Fuente: Editado de (Chamberlain, Gibbs, Rainer, & Nguyen, 1998)

Metodología PRIMERS UTILIZADOS EN LA PCR Tabla 3. Primers utilizados para la amplificación en la PCR de Toxoplasma 193 pb Tabla 5. Primers utilizados para la amplificación en la PCR de los Herpesvirus Fuente: Instituto de Biomedicina, 2010 Tabla 4. Primers utilizados para la amplificación en la Nest-PCR de Toxoplasma. 98 pb Tabla 6. Primers utilizados para la amplificación en la Nest-PCR de los Herpesvirus.

Metodología CONCENTRACIONES DE REACTIVOS - MASTER MIX Tabla 7. Master Mix en la PCR - Toxoplasma Tabla 9. Master Mix en la m. PCR - Herpesvirus Tabla 8. Master Mix en la Nest-PCR - Toxoplasma. Tabla 10, Master Mix en la Nest-m. PCR - Herpesvirus

Metodología CONDICIONES PCR y m. PCR TOXOPLASMA 94°C 55°C 72°C 35 ciclos Figura 24: . Condiciones de PCR para Toxoplasma HERPES VIRUS 94°C 53°C 72°C 3 o ciclos Figura 25: . Condiciones de PCR para Herpesvirus

Metodología PROCESO Nest-PCR y Nest-m. PCR TOXOPLASMA 94°C 55°C 72°C 20 ciclos Figura 26. Condiciones Nest-PCR para Toxoplasma HERPES VIRUS 94°C 53°C 72°C 3 o ciclos Figura 27. Condiciones de Nest-m. PCR para Herpesvirus

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

EXTRACCION DE ADN Figura 11. Concentración de ADN y radio a A 260/A 280 Figura 28. Electroforesis en gel de agarosa al 1. 5% CONTAMINACION > 60%

Resultados y Discusión VISUALIZACIÓN DE AMPLICONES A 98 pb B 140 pb 120 pb 100 pb 68 pb Figura 29. Identificación de los agentes TORCH por medio del producto amplificado en A Nest-PCR para Toxoplasma y B Nest-m. PCR para los Herpesvirus HSV VVZ CMV EBV

Resultados y Discusión % 62 38 15 25 42 65 35 13 26 69 56 35 6 21 50 61 36 19 19 58 Figura 30. Distribución de muestras TORCH positivas por zonas: SUR: 36%, CENTRO: 16%, NORTE: 23%, VALLES: 25% 61 36 14 23 52

Resultados y Discusión 61 36 14 23 52 % 54 31 9 15 28 67 42 13 22 68 77 54 15 38 69 50 13 50 63 100 Figura 31. Distribución de muestras TORCH positivas por edades: 18 – 22 : 45%, 23 – 27: 41% 29 - 31: 9%, 32 – 35 : 5%

CONCLUSIONES

Conclusiones • La estandarización del proceso de extracción de ADN por Salting Out, permitió la obtención del material genético total Concentración 29. 37 ng/µl, y una relación A 260/A 280 de 1, 7, el nivel de contaminación proteica superior al 60% no afecto la amplificación de los agentes TORCH en las muestras. • La técnica de Nest-PCR propuesta para la identificación del agente Toxoplasma gondii permitió conocer la prevalencia del agente en la población de estudio, . • La combinación de variantes moleculares propuesta para la identificación de los Herpesvirus permitió reportar la prevalencia de dichos agentes en la población femenina en etapa fértil del cantón Quito,

Conclusiones • La prevalencia del agente Toxoplasma gondii en la población Quiteña alcanzo el 52. 1% según este estudio, siendo este valor menor al reportado por (Fernández, Montaño, Basantes, & Ponce, 2014), quien indica que la prevalencia de Toxoplasma en Quito es del 72%, pero con una muestra menor a la de estudio. • La prevalencia de los agentes pertenecientes a los herpesvirus alcanzo el 81% en la población de estudio dividido de la siguiente manera: HSV-1 (61%), CMV (36. 3%), VVZ (22. 6%), EBV (13. 7%), (Luchsinger, Luzoro, & Martínez, 2015), (Mosalve Castillo, 2013), (Cofré, Delpiano, & Labraña, 2016) reportan una prevalencia más alta en varios agentes de los herpesvirus pero en población general y población con VIH. • Se determinó que el 90% de las participantes de estudio albergan algún agente TORCH, siendo los agentes HSV-1, Tg, CMV los que tienen mayor prevalencia con un 61%, 52% y 36% respectivamente, así mismo son sus coinfecciones las que tienen mayor prevalencia en el grupo de estudio.

Conclusiones • Se identificó en el grupo de estudio que la edad comprendida entre los 18 y 27 años es la que presenta mayor prevalencia de agentes TORCH, alcanzando un 75% de todos los casos positivos, siendo este a su vez el rango de edad de mayor fertilidad femenina (Gracia, 2015) • Las zonas con mayor prevalencia para cualquier agente TORCH en el cantón Quito es la zona sur de la ciudad y la comprendida en los valles, pues abarcan alrededor del 70% de todos los casos positivos para los agentes de estudio. • Las mujeres entre 18 y 27 años de las zonas del sur y valles de Quito son las que tienen mayor probabilidad de desarrollar infecciones TORCH durante el embarazo, si no se toman medidas necesarias como la recomendación de una prueba de identificación molecular de los agentes TORCH previo al embarazo.

RECOMENDACIONES

Recomendaciones • Retomar el uso del método de Salting Out para la obtención de material genético en investigaciones que partan de muestras sanguíneas, puesto que permitirá abaratar costos sin afectar la calidad de ADN obtenido en el proceso de extracción. • Realizar estudios que permitan conocer la prevalencia de los agentes TORCH a nivel nacional, por provincias o en al menos las tres ciudades con mayor población debido a que son poblaciones con mayor riesgo y de esta manera conocer si existen o no diferencias significativas con el presente estudio. • Determinar la prevalencia de los agentes TORCH en una población con un mayor rango de edad, tanto en población sana como en población inmuno-deprimida y corroborar diferencias significativas dentro de estas poblaciones de estudio.

Recomendaciones • Determinar la correlación de agentes TORCH con problemas antes, durante y después del embarazo en los principales hospitales materno-infantil del Ecuador y conocer la incidencia directa de estos agentes tanto en la madre como en el feto o recién nacido. • Realizar estudios posteriores que permitan identificar si los agentes TORCH que afectan a la población ecuatoriana pertenecen a las mismas cepas víricas identificadas en otras partes del mundo y por medio de los cuales se desarrollan antivirales o antiparasitarios.

AGRADECIMIENTOS

Dra. Patricia Jiménez Arias, Ph. D. Dr. Enrique Terán, Ph. D, Lic. Sandra Vivero, M. Sc. IBM & HMES Dr. Peter Chedrahui, Ph. D Blgo. Saul Escobar, Ph. D