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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA TRABAJO DE TITULACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO AGROPECUARIO TEMA: “ESTUDIO DEL EFECTO HORMÉTICO Y ANTIMICROBIANO DE NANOPLATA EN LA REGENERACIÓN IN VITRO EN MORA DE CASTILLA (Rubus glaucus)” AUTOR: PÁRAMO CABRERA, CARLOS IVÁN DIRECTOR: ING. LANDÁZURI ABARCA, PABLO ANÍBAL SANGOLQUÍ 2018

INTRODUCCIÓN Origen silvestre, zonas semitropicales Rico en minerales y vitaminas Es un recurso alimenticio

INTRODUCCIÓN Origen silvestre, zonas semitropicales Rico en minerales y vitaminas Es un recurso alimenticio de excelente calidad 5142 has en Ecuador Pequeños y medianos productores Reino: Clase: Orden: Familia: Género: Especie: Vegetal, Angiosperma, Rosae, Rosaceae, Rubus, Glaucus, Floribundus, Gigantus. Nombre científico: Rubus glaucus Nombre vulgar: mora

Producción normal 3 kg. planta-1 por año Producción óptima 5 kg. planta-1 por año

Producción normal 3 kg. planta-1 por año Producción óptima 5 kg. planta-1 por año • Mal manejo agronómico • Inadecuado control de plagas y enfermedades • Gran cantidad de variabilidad genética de las plantas

Propagación Asexual Problemas de la propagación Alto porcentaje de mortalidad al trasplante • Sistema

Propagación Asexual Problemas de la propagación Alto porcentaje de mortalidad al trasplante • Sistema radicular débil • Pérdidas de material vegetal • Dinero y tiempo • Problemas fitosanitarios Solución MICROPROPAGACIÓN

Micropropagación Método de propagación vegetativa La producción a gran escala de plantas Libres de

Micropropagación Método de propagación vegetativa La producción a gran escala de plantas Libres de agentes patógenos Cultivo in vitro Programas de mejoramiento Células Tejidos Producir plantas de calidad Órganos Partir de genotipo selecto Tasa de multiplicación ilimitada Embriones Plantas enteras

VENTAJAS INCONVENIENTES Producción de vitroplantas en un espacio pequeño Contaminación endógena y la presencia

VENTAJAS INCONVENIENTES Producción de vitroplantas en un espacio pequeño Contaminación endógena y la presencia de fenoles Costos de producción son bajos Pequeñas cantidades de material vegetal (explantes o microestacas) Propagación de especies que presentan dificultad mediante métodos tradicionales Adaptación en campo de vitroplantas Se requiere personal de laboratorio especializado

Aislamiento del material vegetal Formación de raíces adventicias FASES DE LA MICROPROPAGACIÓN Ciclos de

Aislamiento del material vegetal Formación de raíces adventicias FASES DE LA MICROPROPAGACIÓN Ciclos de multiplicación sucesivos (subcultivos) Obtención de plantas

Nanopartículas de plata (1 – 100 nm) tienen propiedades ópticas, electrónicas y antibacterianas únicas

Nanopartículas de plata (1 – 100 nm) tienen propiedades ópticas, electrónicas y antibacterianas únicas Inhibir efectos del etileno Esterilización de medios de cultivo Empleadas para desinfección de explantes Eliminación de virus in vitro Elaborado en Rusia

Efecto hormético Es el fenómeno en el que un tóxico o una sustancia dañina,

Efecto hormético Es el fenómeno en el que un tóxico o una sustancia dañina, en cantidades o dosis pequeñas, produce efectos estimulantes en el desarrollo en organismos

Objetivo General Evaluar el efecto hormético y antimicrobiano de la nanoplata en la regeneración

Objetivo General Evaluar el efecto hormético y antimicrobiano de la nanoplata en la regeneración in vitro en la mora de castilla (Rubus glaucus).

Objetivos Específicos • Determinar el efecto antimicrobiano de cuatro dosis de nanoplata en medio

Objetivos Específicos • Determinar el efecto antimicrobiano de cuatro dosis de nanoplata en medio MS en la fase de introducción in vitro en mora de castilla (Rubus glaucus). • Evaluar el efecto hormético de cuatro dosis de nanoplata en medio MS en la fase de multiplicación in vitro en mora de castilla (Rubus glaucus). • Determinar el efecto hormético sobre el sistema radicular de cuatro dosis de nanoplata en medio MS líquido en la fase de enraizamiento en vitroplantas de mora de castilla (Rubus glaucus).

METODOLOGÍA Laboratorio de fisiología vegetal de la Carrera de Ingeniería Agropecuaria temperatura promedio 220

METODOLOGÍA Laboratorio de fisiología vegetal de la Carrera de Ingeniería Agropecuaria temperatura promedio 220 C humedad relativa del 62% luz PAR (photon active reaction) de 14, 6 µmol. m-2. s-1.

Diseño experimental Nº de tratamientos T 1 T 2 Nomenclatura Descripción M 0 M

Diseño experimental Nº de tratamientos T 1 T 2 Nomenclatura Descripción M 0 M 25 Medio sin nanoplata Medio con 25 mg. L-1 de nanoplata T 3 M 50 Medio con 50 mg. L-1 de nanoplata T 4 T 5 M 75 M 100 Medio con 75 mg. L-1 de nanoplata Medio con 100 mg. L-1 de nanoplata 7, 5 cm 9 cm 7, 5 cm 6 cm El ensayo para pruebas de laboratorio en micropropagación en las tres fases de la regeneración in vitro en mora de castillas, se dispuso bajo un diseño completamente al azar, con cinco tratamientos y cinco repeticiones

Medio de cultivo Murashige & Skoog (1952) AGAR 0, 6% SUCROSA 1, 5% HORMONAS

Medio de cultivo Murashige & Skoog (1952) AGAR 0, 6% SUCROSA 1, 5% HORMONAS • BENCIL ANIMO PURINA • ACIDO INDOL ACETICO • ACIDO INDOL BUTIRICO SALES AL 50% • NITRATOS • FOSFATOS • SULFATOS • CLORUROS • EDTA VITAMINAS • TIAMINA • GLICINA • ACIDO NICOTINICO • PIRIDOXINA p. H: 5, 8 Condiciones de autoclavado • 121 ºC • 0, 1 MPa • 20 minutos AIA BAP 0, 1 mg. L-1 0, 5 mg. L-1 0, 3 mg. L-1 0, 75 mg. L-1 AIA 0, 2 mg. L-1 BAP 0, 5 mg. L-1 AIB 0, 5 mg. L-1 sin agar (medio líquido)

Métodos específicos del experimento en la fase de introducción in vitro en mora de

Métodos específicos del experimento en la fase de introducción in vitro en mora de castilla (R. glaucus). Obtención del material vegetal (explantes)

Proceso de desinfección Tres enjuagues con agua destilada estéril Microestacas 2 cm

Proceso de desinfección Tres enjuagues con agua destilada estéril Microestacas 2 cm

1 cm de altura 4 a 5 hojas Los brotes fueron separados de la

1 cm de altura 4 a 5 hojas Los brotes fueron separados de la yema axilar de la microestaca Medio de cultivo MS líquido

VARIABLES MEDIDAS

VARIABLES MEDIDAS

Contaminación y fenolización Porcentaje y presencia de contaminación y fenoles in vitro en la

Contaminación y fenolización Porcentaje y presencia de contaminación y fenoles in vitro en la fase de introducción, multiplicación y enraizamiento de mora de castilla Simbología Área del envase (cm 2) Porcentaje (%) + 0, 1 – 9 0, 1 - 33 ++ 9 – 18 33 - 66 +++ 18 – 27 66 - 100 Ausencia de contaminación o fenoles

2 Altura 1 3 1234 12 espectrofotómetro (spectro. Flex 6600) 664 nm y 649

2 Altura 1 3 1234 12 espectrofotómetro (spectro. Flex 6600) 664 nm y 649 nm

RESULTADOS Y DISCUSIÓN C Contaminación F Fenolización Fase de introducción Fase de multiplicación F

RESULTADOS Y DISCUSIÓN C Contaminación F Fenolización Fase de introducción Fase de multiplicación F C 80% 100% 60% 40% 20% C F 40% 20% 20% 0% Fase de enraizamiento C F 0% 0% 0% C F 0% 0% 0%

Sigarroga A. y Garcia C. (2011) Spinoso et al. (2017) Dosis de 0 y

Sigarroga A. y Garcia C. (2011) Spinoso et al. (2017) Dosis de 0 y 25 mg. L-1 de nanoplata 8, 33% y 16, 66% Medios nutritivos enriquecidos con hormonas adicionales Los explantes también desarrollan fenolización 9, 3% para el tratamiento T 1 Dosis de 50, 100 y 200 mg. L-1 de nanoplata, 0% de contaminación 25 y 50 mg. L-1 de nanoplata (Argovit) no detienen el desarrollo de fenoles totales. 16, 1% en el tratamiento T 2 Cancino et al. (2015) T 1 (Isodine 2% por 10 minutos, fungicida Mertec 0, 4% por 30 minutos y alcohol 70% por 30 segundos) 49, 7% en el tratamiento T 1 T 2 (Isodine 2% por 10 minutos, fungicida Mertec 0, 4% por 60 minutos y alcohol 70% por 60 segundos) 16, 5% en el tratamiento T 2 Tratamientos de desinfección superficial

Fase de multiplicación Tratamiento Clorofila A (µg. m. L-1) Clorofila B (µg. m. L-1)

Fase de multiplicación Tratamiento Clorofila A (µg. m. L-1) Clorofila B (µg. m. L-1) Clorofila Total (µg. m. L-1) M 0 23, 14 ± 4, 07 a 13, 39 ± 4, 02 a 36, 53 ± 7, 32 a M 25 26, 13 ± 6, 94 a 16, 66 ± 12, 42 ab 42, 79 ± 18, 91 a M 50 34, 26 ± 0, 84 b 27, 53 ± 5, 83 c 61, 79 ± 6, 56 b M 75 34, 03 ± 1, 07 b 23, 24 ± 6, 3 abc 57, 53 ± 7, 04 b M 100 32, 73 ± 1, 21 b 24, 8 ± 6, 64 bc 57, 53 ± 6, 91 b Spinoso et al. 50 mg. L-1 de nanoplata (Argovit) mg. m. L-1) clorofila A (0, 10 clorofila B (0, 11 mg. m. L-1) clorofila total (0, 21 mg. m. L-1) Mayor contenido de clorofila M 0 Fase de enraizamiento Clorofila A Clorofila B -1 (µg. m. L ) (µg. m. L-1) 16, 58 ± 3, 1 a 10, 15 ± 3, 15 a Clorofila Total (µg. m. L-1) 26, 73 ± 3, 98 a M 25 24, 2 ± 6, 57 b 13, 63 ± 11, 21 ab 37, 83 ± 16, 06 a M 50 35, 89 ± 0, 25 d 34, 98 ± 1, 98 d 70, 86 ± 2, 15 c M 75 31, 02 ± 3, 44 c 20, 87 ± 7, 8 bc 51, 9 ± 10, 07 b M 100 34, 34 ± 1, 57 cd 26, 27 ± 5, 42 cd 60, 62 ± 6, 59 bc Tratamiento

Altura primer brote (1) (cm) Número de Brotes M 0 1, 4 ± 0,

Altura primer brote (1) (cm) Número de Brotes M 0 1, 4 ± 0, 55 a M 25 1, 6 ± 0, 89 ab M 75 2 ± 0, 71 ab M 0 1, 08 ± 0, 41 a M 100 2 ± 0 ab M 25 1, 7 ± 0, 57 b Fase de introducción M 50 2, 2 ± 0, 45 b Número de hojas (1) M 100 1, 6 ± 0, 14 ab M 50 2, 3 ± 0, 45 c Altura segundo brote (2) (cm) M 0 2, 2 ± 1, 1 a M 75 4, 8 ± 0, 84 cd M 25 3, 4 ± 0, 55 b M 100 3, 8 ± 0, 84 bc M 50 5, 6 ± 0, 89 d M 75 1, 7 ± 0, 45 b M 0 0, 3 ± 0, 45 a M 75 0, 96 ± 0, 59 bc M 25 0, 4 ± 0, 55 ab M 100 0, 96 ± 0, 09 cd M 50 1, 6 ± 0, 22 d

Sigarroga A. y Garcia C. (2011) M 2 (medio con ácido indol acético) M

Sigarroga A. y Garcia C. (2011) M 2 (medio con ácido indol acético) M 1 (medio con ácido giberélico) 0, 57 cm 1, 21 cm 2, 45 5, 58 Crecimiento promedio del brote Número de hojas Sin el desarrollo de un segundo brote (A) Máxima respuesta estimulante (B) zona hormética, el ancho de la respuesta Menor desarrollo en el número de hojas Efecto de reguladores de crecimiento estimulante calculado desde el más bajo a la más alta concentración que muestra una 1 ppm de BAP y 0, 5 ppm de ácido giberélico respuesta con la respuesta de control (C) Cancino et al. (2015)

Altura brote principal (cm) Número de brotes M 0 0, 20 ± 0, 45

Altura brote principal (cm) Número de brotes M 0 0, 20 ± 0, 45 a M 75 1, 20 ± 0, 84 ab M 0 2, 64 ± 0, 53 a M 75 3, 92 ± 0, 94 b M 25 1 ± 1 a M 100 0, 60 ± 0, 89 a M 25 3, 16 ± 0, 48 ab M 100 3, 56 ± 0, 62 b Fase de multiplicación M 50 2, 60 ± 1, 34 b Número de hojas brote principal M 0 15, 40 ± 1, 34 a M 75 23, 60 ± 1, 34 c M 25 18, 80 ± 0, 84 b M 100 22, 20 ± 0, 84 c M 50 26, 40 ± 2, 07 d M 50 4, 02 ± 0, 66 b

Altura primer brote (cm) Número de hojas primer brote M 75 1, 12 ±

Altura primer brote (cm) Número de hojas primer brote M 75 1, 12 ± 0, 63 bc M 0 0, 24 ± 0, 54 a M 100 0, 72 ± 0, 67 ab M 25 0, 70 ± 0, 65 ab M 50 1, 70 ± 0, 23 c M 0 1, 20 ± 2, 68 a M 75 5, 20 ± 3, 11 bc M 25 3, 80 ± 3, 49 ab M 100 3, 40 ± 3, 13 ab Fase de multiplicación M 50 9, 60 ± 2, 88 c Número de hojas del segundo brote Altura segundo brote (cm) M 0 0 ± 0 a M 25 0, 40 ± 0, 55 ab M 50 0, 94 ± 0, 56 b M 75 0, 42 ± 0, 58 ab M 0 0 ± 0 a M 75 2 ± 2, 74 ab M 100 0, 20 ± 0, 45 a M 25 1, 60 ± 2, 19 ab M 100 1 ± 2, 24 a M 50 4, 80 ± 2, 95 b

Sigarroga A. y Garcia C. (2011) Tratamientos con fitohormonas Coeficientes de multiplicación bajos Spinoso

Sigarroga A. y Garcia C. (2011) Tratamientos con fitohormonas Coeficientes de multiplicación bajos Spinoso et al. (2017), 25 mg. L-1 50 mg. L-1 14, 33 14, 89 4, 42 cm 4, 71 cm (A) Máxima respuesta estimulante (B) zona hormética, el ancho de la respuesta Número de brotes estimulante calculado desde el más bajo a la Longitud de brotes más alta concentración que muestra una respuesta con la respuesta de control (C) 50 mg. L-1 son suficientes para permitir un desarrollo adecuado de los brotes.

Altura vitroplanta (cm) Número de hojas vitroplanta M 0 2, 12 ± 0, 33

Altura vitroplanta (cm) Número de hojas vitroplanta M 0 2, 12 ± 0, 33 a M 75 2, 38 ± 0, 24 ab M 0 15, 20 ± 4, 76 ab M 75 20, 40 ± 4, 72 bc M 25 2, 42 ± 0, 39 ab M 100 2, 54 ± 0, 60 ab M 25 17 ± 3, 61 ab M 100 13, 80 ± 3, 63 a Fase de enraizamiento M 50 23, 40 ± 5, 37 c M 50 2, 82 ± 0, 41 b Número de raíces Longitud primera raíz (cm) M 0 1, 60 ± 1, 82 a M 75 2 ± 1, 22 a M 0 1, 52 ± 1, 53 a M 75 1, 96 ± 2 a M 25 2, 60 ± 2, 61 a M 100 2, 40 ± 2, 19 a M 25 2, 02 ± 2, 79 a M 100 1, 96 ± 2, 09 a M 50 3, 40 ± 1, 95 b M 50 3, 38 ± 1, 30 b

Porcentaje de enraizamiento (%) M 0 M 25 - 20 M 50 M 75

Porcentaje de enraizamiento (%) M 0 M 25 - 20 M 50 M 75 60 60 M 100 20

Cancino et al. (2015) Reguladores de crecimiento Menor desarrollo en el sistema radicular 63%

Cancino et al. (2015) Reguladores de crecimiento Menor desarrollo en el sistema radicular 63% de enraizamiento Tres raíces y una longitud de 1, 33 cm Auxinas al medio de cultivo (A) Máxima respuesta estimulante (B) zona hormética, el ancho de la respuesta estimulante calculado desde el más bajo a la más alta concentración que muestra una respuesta con la respuesta de control (C) y (D) umbral tóxico Vaca I. , (2012)

CONCLUSIONES Logró el mejor efecto hormético y antimicrobiano en la regeneración in vitro de

CONCLUSIONES Logró el mejor efecto hormético y antimicrobiano en la regeneración in vitro de plantas de mora de castilla (Rubus glaucus). Permite el incremento de brotes, mayor número de hojas, mayor altura de brote y contenido de clorofila Permite obtener un mayor desarrollo del sistema radicular y contenido de clorofila en las vitroplantas Efecto antimicrobiano y reducción de fenolización (0%) 50 mg. L-1 de nanoplata

RECOMENDACIONES Para la regeneración in vitro de mora de castilla, en las fases de

RECOMENDACIONES Para la regeneración in vitro de mora de castilla, en las fases de introducción, multiplicación y enraizamiento, es imprescindible suplementar nanoplata a dosis de 50 mg. L-1 de medio de cultivo, para evitar contaminación cruzada y endógena además de obtener brotes y vitroplantas con mejor desarrollo. Se recomienda no usar dosis de nanoplata, en concentraciones mayores a 50 mg en el medio de cultivo, ya que no permite el desarrollo adecuado de explantes, brotes y vitroplantas. Para evitar el frecuente amarillamiento de hojas in vitro, se recomienda el uso de nanoplata en el medio de cultivo.