DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA TESIS PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO AGROPECUARIO “IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS ESPECÍFICOS DE Piper carpunya, CON ACCIÓN ANTI FÚNGICA. ” LIZBETH NATHALY LOPEZ MORALES DIRECTOR: Dr. Carlos Cárdenas Tello.

INTRODUCCIÓN Justificación del problema Metabolitos secundarios entre los más importantes están los liganos, neoliganos, piperolidas, flavonas. Las técnicas de obtención, aislamiento y caracterización de metabolitos secundarios en plantas, son métodos analíticos que requieren protocolos específicos de identificación. Varios estudios dan a conocer que muchas plantas sintetizan metabolitos secundarios con principios activos potentes de acción biológica.

OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL v Identificar y caracterizar mediante cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas, los metabolitos secundarios presentes en los fitofluidos obtenidos de Piper carpunya (Ruiz & Pav. ). OBJETIVOS ESPECÍFICOS v Evaluar el solvente orgánico más eficaz en la extracción de metabolitos secundarios presentes de los fitofluidos de Piper carpunya. v Realizar pruebas de identificación cualitativa de los extractos obtenidos mediante tamizaje fitoquímico. v Caracterizar por cromatografía de gases a los metabolitos presentes en los fitofluidos de Piper carpunya y evidenciarlos en base al NIST 14

REVISIÓN DE LITERATURA

ESPECIE EN ESTUDIO • Piper carpunya (Ruiz & Pav), pinku o guaviduca, . • Utilizada por la comunidad Tsáchilas • En el Ecuador se registra desde los 350 m s. n. m. hasta los 3000 m s. n. m. , le conocen con varios nombres vernáculos según las zonas de vida y poblaciones (RENAJABO. , 2008). El 12% de la especie P. carpunya ha sido tomadas de diferentes zonas para análisis fitoquimicos correspondiendo asi aproximadamente a 84 especies (Trabadela et al. , 2009).

FAMILIA PIPERACEAE • La familia Piperácea cuenta con más de 3610 especies agrupadas de 10 a 12 géneros. • Se encuentran distribuidos a nivel mundial tanto en regiones tropicales y subtropicales del mundo de las cuales se consideran como plantas medicinales en Latinoamérica

TAXONOMIA REINO VEGETAL Phylum: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Orden: Piperales Familia: Piperaceae Género: Piper Especie: Piper carpunya Fuente: (Yong. , 2004)

EXTRACTOS BOTÁNICOS Las plantas se caracterizan por poseer extractos medicinales debido a la presencia de determinados compuestos de origen natural. Los aceites esenciales son constituyentes principales de terpenos. El uso de los extractos botánicos está siendo frecuente en varios cultivos florícolas. el control de plagas en especial hongos.

MÉTODOS PARA LA OBTENCION DE EXTRACTOS BOTANICOS Extracción con disolventes Destilación por arrastre de vapor Maceración Extracción por fluidos supercríticos Decocción Destilación con agua Percolación Infusión Digestión

METABOLITOS SECUNDARIOS Los metabolitos secundarios son compuestos orgánicos que se encuentran en infinidad de plantas y con diversas propiedades. Clases principales TERPENOS Entre los que se encuentran hormonas, pigmentos o aceites esenciales los cuales cuentan con propiedades antifúngicas COMPUESTOS FENOLICOS Cumarinas, flavo noides y taninos son inhibidores enzimáticos, atrayentes polinizadores. GLICOSIDOS Saponinas y glucosinolatos cumplen con funciones de defensa y con propiedades detergentes. ALCALOIDES Compuestos nitrogenados alifáticos (no cíclicos) como la mescalina o la colchicina, cumplen con funciones tranquilizantes y analgésicas.

LA CROMATOGRAFIA La cromatografía es una técnica analítica que permite separar los componentes de una mezcla compleja y analizar individualmente cada uno de los componentes, además identifica compuestos, determinando picos y tiempos de retención (Parra J. , 2011).

MATERIALES Y MÉTODOS

Material experimental Materiales de Laboratorio

REACTIVOS EQUIPOS DE LABORATORIO Cromatografía de gases acoplado a masas

Métodos PREPARACION DE LOS EXTRACTOS 1) Recolección de la materia prima 2) Tratamiento de la muestra 3)Deshidratación de la muestra 4) Molienda y pesaje

Técnicas de extracción 1) Obtención del extracto 2) Obtención del extracto por hidrodestilación. por maceración.

Tamizaje Fitoquímico. Tabla 1. Pruebas de los principales metabolitos a describirse Reactivos y pruebas Metabolitos registrados Tabla 2. Significación considerada para reportar los resultados de las pruebas de tamizaje fitoquímico Significación Especificación Comentario ( - ) No registrado No hay cambio de coloración. ( +/- ) Escasa presencia Mínimo cambio de coloración. ( + ) Ligera presencia Leve cambio de coloración. ( ++ ) Estable presencia Notable cambio de coloración. ( +++ ) Constante presencia Prolongado cambio de coloración. ( ++++ ) Abundante presencia Cambio de coloración. fotoquímicas Reactivo de Mayers Reactivo de Dragendorff Alcaloides Reactivo de Wagner Ensayo con cloruro férrico Taninos y fenoles Ensayo de saponificación Saponinas espumante Ensayo hidróxido de Cumarinas potasio al 10% Ensayo de shinoda Flavonoides Ensayo de borntrager Quinonas

PROTOCOLO DE TAMIZAJE FITOQUIMICO Reconocimiento de alcaloides -Se tomo una alícuota de 1 ml y se disolvió en 2 ml de ácido clorhídrico al 10%. -Mayer’s: al 1 ml se adicionó 5 gotas del reactivo. -Dragendorff: al 1 ml se adicionó 3 gotas del reactivo. -Wagner: al 1 ml se adicionó 3 gotas del reactivo Protocolo para reconocimiento de taninos y fenoles (Ensayo del cloruro férrico) -1 ml por cada tubo de ensayo -3 gotas de acetato de sodio para y 0. 5 ml de una solución de Cloruro férrico al 5 % en solución salina. -Azul intensa, indicando pirogalotánicos Protocolo para reconocimiento de saponinas (Ensayo de espuma) - Alicuota de 1 ml y se diluyo 5 veces su volumen en agua. -Se agitó la mezcla entre 5 a 10 minutos. -Espuma con burbujas , con alturas entre -4 mm hasta 20 mm, por más de 2 minutos

Protocolo para reconocimiento de flavonoides Ensayo de shinoda -1 ml , y se las diluyó con 1 ml de HCl concentrado -0. 5 cm de cinta de magnesio metálico como indicador, -Se añadió 1 ml de alcohol amílico, -gamas que fueron del amarillo al naranja el ensayo dio positivo Ensayo de antocianinas -1 m. L de la muestra se calentó por 2 minutos -1 m. L de HCI concentrado y se calentó por 10 minutos -1 m. L de agua y 2 m. L de alcohol amílico. -Por último se agitó el tubo de ensayo y se dejó separar las 2 fases. -coloreó de rojo a marrón

Protocolo para reconocimiento de cumarinas -1 ml , y se les añadió 3 gotas KOH al 10%, dando una coloración amarillenta. - 0. 5 ml de HCl 1 N. -Desvaneció el color amarillento al acidularlos con el HCl 1 N Protocolo para reconocimiento de quinonas (Ensayo de börntrager) -1 ml para cada tubo de ensayo y se sometieron a baño maría. -1 ml de hidróxido de potasio al 10 %, se agitó el tubo de ensayo -Cloroformo. - se coloreó de rosado a rojo

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

alc Ma a- y A Dra lc a- g W Ta ag Sa nin po os C ni um na Fl a s av rin A on as nt o oc id ia es n Q in ui as no na s 0. 00 lc ETANOL DE CAÑA A 5. 00 4. 00 3. 00 2. 00 1. 00 0. 00 4. 00 3. 00 2. 00 1. 00 Quinonas Antocianinas Flavonoides Cumarinas Saponinas Taninos Alca-Wag Alca-Drag Alca-May HEXANO A A lc A a-M lc a a y A -Dr lc a a- g W Ta a Sa ni g p no C oni s u n Fl ma as av ri A on na nt o s oc id ia es Q nin ui a no s na s EVALUACION DEL SOLVENTE ORGANICO ETANOL COMERCIAL AGUA 5. 00 0. 00 Figura 1. Análisis de metabolitos secundarios presentes en Piper carpunya mediante tamizaje fitoquímico con 4 solventes orgánicos Hexano, Etanol comercial, Etano de caña y agua

HIDROLATO DE Piper carpunya PERFIL CROMATOGRÁFICO (GC-MS) DEL HIDROLATO DE P. CARPUNYA; CAPTÁNDOSE A: 2 - ISOPROPOXIETIL-AMINA; 1 -PROPANAMINA ; D-NORLEUCINA ; PENT-4 -ENIL-AMINA; 1, 8 -DIAMINO-OCTANO Y BUTANAL 3 HIDROXI.

MACERADO DE Piper carpunya SE MUESTRA EL PERFIL CROMATOGRÁFICO (GC-MS) DEL MACERADO DEP . CARPUNYA. EN ETOH-CAÑA, CAPTÁNDOSE A: ETIL-AMINA ; 1, 4 -BUTAN, DIAMINA

Tabla 3 Metabolitos descritos en hidrolato y macerado de P. carpunya Extracto analizado Barrido Metabolito descrito Tiempo retención min 2653 2 -Isopropoxietil-amina. 9. 91 4493 GC-MS 2204 1 -Propanamina. 11. 64 2427 GC-MS Hidrolato 2379 D-Norleucina. 12. 56 13424 GC-MS 2417 Pent-4 -enil-amina. 12. 76 1541 GC-MS 2671 1, 8 -Diamonio-octano. 14. 09 20253 GC-MS 3165 Butanal, 3 hidroxi 16. 68 1994 GC-MS 1338 Etil-amina 7. 10 85 GC-MS 2379 1, 4 -Butan, di-amina 12. 56 1935 GC-MS Macerado Et. OH-caña de # identificación (Tr) Método analítico

2 - Isopropoxietil-amina (Isopropil Metil-amina) Es un gas derivado del amoniaco, es la amina primaria más sencilla dentro de este grupo (Carda et al. , 2011). Pent-4 -enil-amina PUTRESCINA Este compuesto orgánico, es una diamina lineal compuesta de ocho átomos de carbono con dos grupos amino primario (Peluso et al. , 2006). 1 -Propanamina D-Norleucina Es una amina primaria Es un aminoácido no natural el cual se utiliza para conocer la estructura y función de proteínas. (Renjifo et al. , 2014). que se condensa desde la reacción de amoniaco (Butch et al. , 2016). Butanal, 3 Hidroxi Es un Aldehído más denso que el agua tiene toxicidad por ingesta, inhalación o absorción por la piel (Butch et al. , 2016).

HIDROLATO DE Piper carpunya Perfil Cromatográfico del hidrodestilado de P. carpunya, se captó picos más relevantes citados en la tabla 4.

MACERADO DE Piper carpunya Perfil cromatográfico del macerado de P. carpunya en Etanol-caña, se captó picos más relevantes citados en la tabla 4.

Perfil cromatográfico del macerado de P. carpunya. en Etanol-comercial, se captó picos más relevantes citados en la tabla 4.

Perfil cromatográfico del macerado de P. carpunya en agua, se captó picos más relevantes citados en la tabla 4.

Tabla 4 Metabolitos descritos en hidrolato y macerado de P. carpunya Extracto analizado Hidrolato Macerado Agua Macerado Et. OH-caña Macerado Et. OH-comercial Metabolito descrito Tiempo de retención (Tr) min 1 -8 cineol 4 -Isopropyl-1 -methyl-2 -cyclohexen-1 -ol 5 -Isopropyl-2 -methylbicyclo[3. 1. 0]hexan-2 -ol alfa-terpineol L-à-terpineol à-Limonene diepoxide 4, 7, 7 -Trimethylbicyclo[4. 1. 0]heptan-2 -ol Kemitracin-50 trans-2 -Caren-4 -ol Ascaridol 6 -Isopropyl-3 -methyl-7 -oxabicyclo[4. 1. 0]heptan-2 -one Miristicina z-carpacin Dilapiol Globulol Kemitracin-50 trans-2 -Caren-4 -ol 14. 28 17. 53 20. 38 27. 42 30. 15 33. 37 34. 94 39. 60 42. 07 42. 71 49. 04 27. 42 30. 15 33. 37 34. 94 39. 60 42. 07 Actylol α- Muuroleno Cadaleno 4. 30 20. 38 27. 42 Oxido cariofileno β- Cubebeno Aloaromadendreno Campestero Estigmastero β-sitosterol Stigmasterol 2 E)-3, 7, 11, 15 Tetramethyl-2 -hexadecen-1 -ol 14. 28 17. 53 20. 38 27. 42 30. 15 33. 37 34. 94 65. 18

1 -8 Cineol 4 -Isopropyl-1 -methyl-2 cyclohexen-1 -ol L-à-terpineol Alfa-terpineol Este compuesto es también llamado aceite de eucalipto el cual se obtiene de las hojas de dicha especie (Hidalgo M. , 2011) C 10 H 18 O, este compuesto es conocido como Cironelal, es clave mezcla de compuestos químicos que dan como resultado el aceite de Citronela Este compuesto es uno de los nombres con los que se llama a todo el grupo de terpineol. Es un monoterpeno alcohol que se la puede aislar de diferentes aceites como pino. (Lenma A. , 2008). à-Limonene-diepoxide Es un compuesto que se lo puede obtener de la extracción de los cítricos, pertenece al grupo de los terpenos (Fernandez G. , 2012) 4, 7, 7 -Trimethyl Kemitracin-50 bicyclo[4. 1. 0]heptan-2 -ol Trans-2 -Caren-4 -ol C 8 H 14 O 2, este compuesto El Alcanfor, C 10 H 16 O, es C 10 H 18 O y pertenece a es utilizado para fabricar un terpenoide que se utiliza para anestesias los terpenos y resinas adhesivas y locales, analgésicas y monoterpenos como por aditivos para aceites antipruritas (Ramos A. , ejemplo Eucaliptol (Rueda (NCBI. , 2008). 2010) et al. , 2012)

6 -Isopropyl-3 -methyl 7 oxabicyclo[4. 1. 0]hept an-2 -one. Ascaridol Miristicina Dilapiol La miristicina, metabolito también conocido como Zcarpacin, químicamente corresponde a un fenilpropano, su fórmula es C 11 H 12 O 3 es un aceite (Nuño A. , 2009) Piper aduncum es un árbol más conocido como matico de aquí se extrae para diversos usos la sustancia especifica Dilapiol cumple con la función de biodefensa agrícola (Azambuja, 2013). Es un compuesto natural perteneciente a un monoterpeno cíclico, pertenece principalmente al aceite de paico (Lázaro et al. , 2005). Globulol es una de las sustancias más relevantes y de mayor uso para la extracción de su aceite esencial (Russo S. , 2013) C 10 H 16 O 2 es un isómero de doble enlace del ácido, el cual cuenta con apitoxinas (NCBI. , 2008) α- Muuroleno Cadaleno El cadaleno pertenece a C 15 H 24, es también los sesquiterpenos los conocida como α – cuales poseen solo 15 Zingibereno o Cubebeno átomos de carbono (Bermudez R. , 2011) (UNAM, 2015). Actylol El Actylol se lo conoce también como lactato de etilo el cual pertenece a los esteres (Anfoteros. , 2017)

. Oxido cariofileno Dicho oxido pertenece al grupo de los Sesquiterpenos, posee caractersticas de actividad anti fúngica (UNAM, 2015). Aloaromadendreno Campesterol Como su nombre químico lo indica Copaeno, es un compuesto derivado de las resinas tropicales (UNAM, 2015). Es un tipo de fitoquimico (fitoesteroles) los cuales tienen propiedades para tratar enfermedades cardiovasculares (Colomer et al. , 2014) Estigmasterol β-sitosterol Pertenece al grupo de los fitosteroles son de origen vegetal y se encuentran presentes en grasas de las plantas (Ostlund et al. , 2003) Este compuesto se encuentra dentro de los fitoesteroles y lo producen únicamente las plantas (Saeidnia et al. , 2014) 2 E)-3, 7, 11, 15 -Tetramethyl-2 -hexadecen-1 -ol C 20 H 40 la cual es Buteno, pertenece al grupo de los alquenos se utiliza en la formación del caucho artificial (Bressa S. , 2001)

DISCUSION García, 2007 describió en Piper auritum a safrol y miristicina. Sánchez, mediante hidrodestilacion mediante Piper marginatum describió a isosafrol. Barbosa et al. , 2008 en la composición química del aceite esencial de las hojas de Piper divaricatum analizadas mediante GC-MS, se identificaron como metileugenol, linalol, ß -pinenoy alfa -pineno Ferraz et al. , 2012 hidrodestilación de Piper amalago , Piper mikanianum , y Piper xylosteoides presentan fenilpropanoides, monoterpenos y sesquiterpenos Jaramillo et al. , 2015 especies de piperáceas, encontrándose principios activos tales como: Piper dilatatum (apiol y trans- cariofileno ), Piper aduncum (dilapiol y cineol), Piper divaricatum (eugenol y metil eugenol ), Piper sp (guaieno y elemol) y Piper sanctifelicis (3 - careno y limoneno) a los cuales se les atribuyo actividad repelente contra insectos

CONCLUSIONES • El etanol de caña, fue el solvente orgánico con mayor capacidad extractiva para mantener inmersos los metabolitos secundarios presentes de Piper carpunya, respecto a los demás solventes empleados. • Los metabolitos descritos e identificados por cromatografía, son un aporte y contribución al estudio fitoquimico de Piper carpunya una especie utilizada etnobiologicamente por la comunidad de los Tsáchilas como planta medicinal. • Los componentes registrados en el equipos de cromatografía, detectan el analito y permiten registrar mayor porcentaje de compuestos de una misma muestra, además de registrar trazas no identificadas. • De acuerdo a la literatura consultada, los metabolitos secundarios descritos, se consideran potencialmente antifúngicos.

RECOMENDACIONES • Utilizar solventes orgánicos polares, con el propósito de mejorar el nivel extractivo de las muestras vegetales. • Usar compuestos orgánicos de amplia volatilidad, para mejorar la captación de analitos presentes en los extractos botánicos. • Programar temperaturas ideales que permitan el fraccionamiento de iones cuantificables y de esta manera puedan ser absorbidos y caracterizados en base a la biblioteca de espectros. • Verificar a través del NIST 14, los analitos presentes, ya que este software de búsqueda, permite identificar una serie de compuestos presentes en las muestras