Deconstruo por Enzimas 1 Celulase ENZIMAS ENVOLVIDAS NA

Deconstrução por Enzimas 1: Celulase

ENZIMAS ENVOLVIDAS NA DEGRADAÇÃO DE CELULOSE - Inicio dos estudos com celulases – II Guerra Mundial Isolamento da cepa QM 6 a de Trichoderma reesei - Desde então se desenvolveram estudos : Ø Isolamento de microrganismos produtores Ø Aumento da produção enzimática por mutação Ø Purificação e caracterização dos componentes do complexo enzimático Ø Compreensão dos mecanismos de degradação Ø Clonagem e expressão de genes de celulases Ø Determinação da estrutura 3 D de celulases Ø Compreensão da relação estrutura-função Ø Demostração do potencial industrial

Organismos celulolíticos Plantas – celulase hidrolisa a parede celular em vários estágios Microrganismos – utilização da fonte de energia Micro-organismo - Bacteria: a n a e r o b i a s (C l o s t r i d i u m , R u m i n o c c u s, F i b r o b a c t e r) aerobica gram-positive (Cellulomonas, Thermobifida) aerobica (Cytophaga, Sporocytophaga) Clostridium Ruminococcus Cellulomonas Cytophaga

Micro-organismo - Protozoario: ciliate (Diplodinium, Eudiplodinium) Protozoa of Diplodinium and Eidinium type attached to fodder molecules in rumen liquid (Dobicki et al. , 2006) - Fungos: conteúdo ruminal (Neocllimastix, Piromyces, Caecomyces) (Orpimomyces, Anaeromyces) Ascomycetes (Bulgaria, Chaetomium, Helotium) Basidiomycetes (Coriolus, Phanerochaete, Serpula) Deuteromycetes (Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, Trichoderma) Piromyces Anaeromyces Chaetomium Phanerochaete Trichoderma

Quais as caracteristicas gerais dos sistemas celulolíticos de micro-organismos? 1) Sistemas não complexados - Multiplicidade de componentes - Sinergismo - Domínio catalítico (CD) e de ligação ao substrato (CBD) - Celulases associadas entre si ou à superfície dos microrganismos 2) Sistemas complexados

Celulossomos (bactérias anaeróbias) Ex. Clostridium thermocellum (AE 50 x maior que a de Trichoderma) A escafoldina Cip. A contém 9 módulos coesina tipo I (vermelho) que se associam a nove enzimas (azul) que possuem o domínio dockerina tipo I (vermelho). A dockerina tipo II (amarelo) no C-terminal de Cip. A interage especificamente com proteínas da superfície celular (como Sbd. A, por exemplo), contendo o domínio coesina tipo II (amarelo). Dockerina ~70 aa; coezinas ~150 aa

Bacterium cell wall Scaffodin Endoglucanase (with dockerin) Exoglucanase (with dockerin) Cohesin moiety Carbohydrate-binding module (CBM) Cellobiose/cellodextrin phosphorylase Glucose Cello-oligosaccharides (Demain et al. , 2005)

Caracteristicas do sistema celulolítico de Cupim -Celulase endógena excretada das glâdulas salivares ou intestino - Celulases de cupim pertencem a familia 9 das glicosil hidrolases - Celulases contendo um único domínio catalítico, mas faltando o dominio de ligação à celulose -Sistema consistindo de celulases endógenas de cupim e celulase de protista de intestinos Hindgut Protist Cellulose decomposition Mid-gut Cellulolytic material Gring Crunch Ingested cellulose endogeneous cellulase CO 2 CH 4 H 2 Acetate Absorbed by termite

Estrutura da celulose Estrutura simples Celobiose Glicose - O que precisamos saber para promover a sua degradação ?

Cerca de 30 moléculas de celulose são empacotadas em unidades maiores chamadas microfibrilas, as quais se associam para formar as fibras celulósicas Lignina Fibrila elementar de celulose Hemicelulose 7 -30 nm Microfibrila

Estrutura da celulose Microfibrilas: domínio cristalino Região amorfa domínio cristalino 1/3 cristalina, 1/3 para-cristalina e 1/3 amorfa (algodão) A celulose nativa tem d u a s formas cristalinas I a e I b V o c e s s a b e m a d i f e r e n ç a?

Avicel (microcristalina) Solka-floc (amorfa e cristalina)

Como agem os ácidos?

Desfibrilação mecânica? Álcali?

E as enzimas? C 1 - Cx – Mandels & Reese

Ação de enzimas Componentes de sistemas celulolíticos 1) Classificação baseada no tipo de reação química catalisada (i) Endo-b-1, 4 -glucanase (E. C. 3. 2. 1. 4) (ii) Exoglucanase (cellodextrinases E. C. 3. 2. 1. 74 or cellobiohydrolase E. C. 3. 2. 1. 91) (iii) b-Glucosidase (E. C. 3. 2. 1. 21) 2) Classificação baseada em homologia de sequencia de aminoácidos e enovelamento (folding)

Endoglucanase (EG) Pertence a mais de 16 famílias: 5, 6, 7, 8, 9, 12, 16, 17, 44, 45, 48, 51, 55, 61, 74 e 81 - Cel 5 A, Cel 7 B, Cel 12 A, Cel 45 A e Cel 61 A T. reesei produz no mínimo 5 EG previamente conhecidas como (EG II, EG III, EG V, e EG IV) - outra EG em T. reesei inclui EGVI (Cel 74 a) , EGVII (Cel 61 B) e EG VIII (Cel 5 B)

- Massa Molar Celulases : 25 – 50 k. Da, p. H ótimo acídico - Endoglucanases de P. chrysosporium 28 e 37 k. Da Enzimas processivas: Tr. Cel 7 A (redutora) e Tr. Cel 6 A (não redutora) (CBH I e II, respectivamente -

Por que o produto é celobiose? Endoglucanase e CBH – diferem no dominio catalítico Endoglucanase – sitio aberto menos restritivo – produtos diferenciados

(55 k. Da) CBH 1 CBD (10 k. Da) Girino - Endoglucanase e celobiohidrolase Linker – 30 a 44 aminoácidos (Pro, Gly, Ser, Thr) Y= Tir; N-Asn; Q - Gln

Celobiohidrolase Glicoproteínas (1 -10% de carbohidratos) - Apresentam dois dominios principais : catalítico (“cabeça”) e de união a celulose (“cauda”)

Estruturas do domínio catalítico de Trcel 7 a (A) e Tr cel 6 A ( C ) Entrada do túnel

Passos de hidrólise da celulose por CBH

Hipótese de mecanismo para Cel 7 A

CBD - Bacteriano: contém baixo conteúdo de aminoácidos carregados, alto conteúdo conservados de trp, asn e gly. de hidroxi-aminoácidos, T. reesei: CBH e Endo-Gluc contém 33 aa CBD – aromáticos (2 Tyr, 1 Trp) e Pro, Gln e Asn – e folhas beta Linker (6 a 59 aa) Dominio catalítico residuos

Remoção de CBD

Familias de CBD Family I II IV Tamanho 33 -40 90 -108 130 -172 125 -170 Forma cunha Barris alongados barris - Ligação irreversível a superfície de celulose insolúvel amorfa e cristalina Reversivel à superfície de celulose insolúvel amorfa insoluvel e soluvel Ligação Caracteristicas Ligação Reversivel à irreversível a superfície de celulose insolúvel amorfa e cristalina Enzimas de fungos duas- subfamilias (IIa e IIb) CBDs de enzimas bacterianas Duas subfamilias (IIIa and IIIb) CBDs de enzzimas bacterianas Enzimas bacterianas

Proteínas com atividade de ruptura de materiais celulósicos EXPANSINAS – Afrouxam as fibras de celulose (Plantas) Rompem pontes de hidrogênio entre as fibrilas de celulose ou entre celulose e outros polissacarídeos da parede celular, sem atividade hidrolítica Saloheimo et al : Eur J Biochem 2002, 269: 4202 -11.

Swolenina Uma proteína com um domínio de endoglucanase e um domínio similar à expansina - Clavibacter michiganensis spp sepedonicus (patógeno de plantas) SS-18 aa QQ CBD Linker Homologia com Expansina Trichoderma reesei, possui um CBD ligado ao N-terminal, com estrutura típica de CBD de celulases CBD de CBH 1 possui 2 pontes de dissulfeto CBD de CBH 2 e EG 1 possuem 2 pontes de dissulfeto CBD de Swo possui 3 pontes dissulfeto (6 cisteínas em posições conservadas) Linker – rico em serina e treonina e muito glicosilada

REGULAÇÃO similar aos genes de celulase T. reesei QM 9414 cultivado em diferentes fontes de carbono e feita a hibridização por Nothern Blot 1 - glicose, 2 - jejum + glicose, 3 - sorbitol, 4 - glicerol, 5 - glicerol + induzida por sophorose 6 - celobiose, 7 - lactose, 8 -celulose, 9, glicose ( superexposta) Eur. J. Biochem. 269, 4202– 4211 (2002) � FEBS 2002

Fibras de algodão (ultra-som e Microscopia) A-sobrenadante 0, 125 g/L swo CBH 1 Causou fibrilação CBD de CBHI EGII Causou ruptura Parede celular de Valonia (alga)

GH 61 Saloheimoet al. 1997 (Finish VTT Group led by Merja. Penttilä) • 56 k. Da; induzida por celulose com um CBM ( T. reesei) • similaridade da sequencia de aminoácidos a proteina CEL 1 de Agaricus bisporus • a Trcellulose-induced protein mostrou atividade de endoglucanase e foi denominada EGIV.

Mistura de duas preparações de celulase SDS-Page das proteínas de T. terrestris cultivado em celulose

Efeito da adiçao de GH 61 de T. aurantiacus e T. terrestris

Familia 33 Resíduos conservados (2 his) (His 28) Ni

Estruturas de GH 61

Qual a função do metal? – fazer a hidrólise na presença de metal para saber

Mutação sítio dirigida em GH 61 M 2+ - Ca, Co, Mg, Mn Zn 2+ - efeito separado pois foi inibitório

CBM 33 ou GH 61 ------ LPMOs LPMOS – lytic polysacharide monooxigenases (AA - enzimas auxiliares) AA 10 – CBP 21 – atua em quitina AA 9 e AA 10 – enzimas ativas em celulose Enzimas dependente de cobre Clivagem oxidativa da celulose Fornecido por moléculas redutoras (galico, ascorbico) ou CDH - lignina celobiônico

MECANISMO DE CELOBIOSE-DESIDROGENASE (CDH) CDH - Produzida extracelularmente por fungos WR, BR e SR - Contém FAD e heme como grupos prostéticos - Quebra proteolítica dá como resultado CBQ (CDH-FAD) Oxidação de celobiose e outras celodextrinas até ácidos, via formação de lactonas, na presença de aceptores de eletrons apropriados. O 2 , Fe(III) Quinonas, DCPIP

AÇÃO COMBINADA DE ENZIMAS CELULOLÍTICAS 5 CDH 6 CBO 7 10 EXOCELULASE PROTEASE 8 LACTONASE 11 b-GLUCOSIDASE 9 ENDOCELULASE 12 GLUCOSE-1 -OXIDASE 13 CATALASE (Sistema celulolítico de P. chrysosporium)