Dani otvorenih vrata IMI 2016 ODREIVANJE PESTICIDA U

Dani otvorenih vrata IMI 2016

ODREĐIVANJE PESTICIDA U BIOLOŠKOM MATERIJALU Gordana Mendaš Jedinica za biokemiju i organsku analitičku kemiju

OPENTOX Organska zagađivala u okolišu - markeri i biomarkeri toksičnosti (09/2014 – 09/2018) • Direktiva 2009/128/EC (Tematska strategija o održivoj uporabi pesticida EU) • Collegium Ramazzini Statement • Kontrola prekomjerne uporabe pesticida radi smanjenja njihovih štetnih učinaka na ljudsko zdravlje i okoliš • Projekt financira Hrvatska zaklada za znanost pod brojem 8366

Sredstava za zaštitu bilja HERBICIDI protiv korova INSEKTICIDI protiv insekata

Predmet istraživanja Insekticidi Herbicidi POPs OP Triazinski Organoklorovi Neonikotinoidi OP PCB Piretroidi Alelopatski

Ciljevi • Razjasniti mehanizam genotoksičnosti pesticida u uvjetima in vitro i in vivo (biomarkeri, posredna izloženost preko placente) • Procijeniti endokrinu disrupciju s obzirom na posrednu izloženost (preko placente i majčinog mlijeka) i razvojno razdoblje pokusnih životinja • Korelirati biomarkere oksidacijskog stresa i biokemijske toksičnosti s rezultatima cito/genotoksičnosti te učincima na citoskelet • Procijeniti genotoksičnost POPs izoliranih iz humanih bioloških uzoraka • Raspodjela, mobilnost i razgradnja odabranih pesticida u vodi i tlu • Integrirati stečena znanja u Hrvatski nacionalni plan održive upotrebe pesticida

Istraživački modeli In vitro • Primarne stanične kulture: • limfocita periferne krvi čovjeka • Živčane stanice štakora • Stanične linije ljudskog: • Hepatom Hep. G 2 • Astrocitom 1321 N 1 • Neuroblastom SHY 5 Y In vivo • Istraživanja na modelu laboratorijskih štakora

Metodologija • Biokemijske metode za procjenu oksidacijskog stresa: GSH, TBARS; TAC; ROS; GSH-Px, SOD • Aktivnost enzima ACh. E i BChe • Citotoksičnost i testovi preživljenja stanica SH-SY 5 Y stanice (fazni kontrast) Određivanja citotoksičnosti (WST-8)

• Procjena primarnih oštećenja in vitro i in vivo- alkalni komet test i FISH alkalni komet test

• Procjena trajnih oštećenja in vitro i in vivo: mikronukleus (cytome) test, FISH mikronukleus test; mikronukleus test in vivo u eritrocitima štakora Mikronukleus FISH Komet FISH (p 53 i myc geni)

Mikronukleus u eritrocitima štakora

• Imunocitokemijske metode-struktura citoskeleta Aktin u SH-SY 5 Y stanice Mikrotubuli u SH-SY 5 Y stanicama

Analitički postupci • Priprava uzoraka • Ekstrakcija: pročišćavanje i ukoncentriranje analita • MW ekstrakcija Ekstrakcija na čvrstoj fazi • Tekuće-tekuće

Kvantitativno određivanje Tekućinska i plinska kromatografija uz selektivne detektore

Istraživačke skupine • Genetička toksikologija pesticida • Endokrina disrupcija spolnih hormona • Stanična i substanična toksičnost • Biokemijski markeri toksičnosti i oksidacijski stres • Razdioba zagađivala u okolišu

Određivanje terbutilazina u urinu štakora izloženih niskim dozama Jedinica za biokemiju i organsku analitičku kemiju • Proširiti spoznaje o ponašanju, porijeklu i raspodjeli specifičnih mikroonečišćenja u okolišu i biološkom materijalu te procijeniti izloženost ljudi • Razviti i validirati analitičke metode za pouzdanu identifikaciju, točno i precizno kvantitativno određivanje organskih mikrozagađivala u okolišu i biološkom materijalu

Postupak Model: 20 mužjaka štakora Wistar oralno izloženih niskim dozama terbutilazina tijekom 28 dana: Ø 0. 0048 mg/kg t. m. / dan (OEL) Ø 0. 48 mg/kg t. m. / dan (100 x. OEL) Ø 2. 29 mg/kg t. m. /dan (1/100 LD 50) UZORAK: 24 -h urin; 1. , 14, 28. dan tretmana Ø Ø Ekstrakcija: Ø Ø Ø 2 ml urina Ekstrakcija s 3 x 4 ml etil acetata Uparavanje u struji N 2 do suhog Otapanje u 0. 5 ml vode Filtriranje – filter 0. 2 µm HPLC- UV DAD analiza

Raspodjela terbutilazina i metabolita u 24 -satnim uzorcima urina: OEL 0. 0048 mg/kg t. m. dan masa / μg 200 day 1 150 day 14 day 28 100 50 0 TERB DET DIA

Raspodjela terbutilazina i metabolita u 24 -satnim uzorcima urina: 100 x. OEL 0. 48 mg/kg t. m. dan 200 masa / μg day 14 day 28 150 100 50 0 TERB DET DIA

Raspodjela terbutilazina i metabolita u 24 -satnim uzorcima urina: 1/100 LD 50 2. 29 mg/kg t. m. dan 400 350 day 1 masa / μg 300 day 14 day 28 250 200 150 100 50 0 TERB DET DIA

Zaključak • Terbutilazin se intenzivno metabolizira dealkiliranjem pri čemu nastaju deizopropilatrazin i deetilterbutilazin

Zaključak • Udio terbutilazina detektiranog u urinu: manje od 2 % doze • Podjednaka zastupljenost oba metabolita neovisno o primijenjenoj dozi • Deetilterbutilazin je specifični metabolit prikladan za potvrđivanje izloženosti terbutilazinu

OPENTOX Organska zagađivala u okolišu - markeri i biomarkeri toksičnosti • 6 izvornih znanstvenih radova u CC časopisima: • 7 kongresnih priopćenja u CC časopisima • 9 kongresnih priopćenja u zbornicima skupova • http: //opentox. imi. hr/index. html • Kontakt: voditelj projekta dr. sc. Davor Želježić • dzeljezic@imi. hr

Hvala na pažnji