Cytometria przepywowa FACS Fluorescence activated cell sorting Facs

Cytometria przepływowa

FACS – Fluorescence activated cell sorting

Facs. Calibur • Producent – Becton Dickinson • Rok produkcji 2010 • System akwizycji danych rejestruje komórki lub cząstki biologiczne przepływające z częstością > 3000 na sek.

Facs. Calibur • Model dwulaserowy: – laser argonowy – 488 nm – laser diodowy – 635 nm – Czterokolorowy czyli 4 fluorescencje: FL 1, FL 2, FL 3 i FL 4

Budowa • Układ ciśnieniowo-cieczowy (pompa, zbiorniki, filtry) – zapewnia przepływ próbki przez aparat • Układ optyczny (laser, pryzmaty, soczewki, filtry) – wzbudzanie i detekcja sygnałów z fluorochromów • Układ elektroniczny (detektory, wzmacniacze) – przetwarzanie i obrazowanie danych

Układ ciśnieniowo-cieczowy zawiesina komórek ciecz osłaniająca fluorescencja promień lasera wg Purdue University Cytometry Laboratories

Układ optyczny Zadania: – Wzbudzanie fluorochromów (barwników) – Detekcja sygnałów z fluorochromów na odpowiednich fotopowielaczach(detektorach)

Układ elektroniczny Zadania: - Przekazanie sygnału z detektorów do komputera. - Przetworzenie informacji na dane graficzne i statystyczne

Analiza cytometryczna określa: – Względną wielkość komórek oraz ich wewnętrzne zróżnicowanie – Badanie struktur komórkowych wyznakowanych odpowiednimi układami przeciwciało-barwnik

Właściwości FSC i SSC Detektor rozproszenia pod kątem 90 stopni Laser Detektor rozproszenia na wprost Rozproszenie na wprost FSC • mierzone wzdłuż osi padającego światła lasera • określa wielkość komórki Rozproszenie boczne SSC • mierzona pod kątem 90° w stosunku do wiązki laserowej • światło laserowe odbite i rozproszone • określa gęstość i liczbę ziarnistości 11

Analiza wieloparametrowa Do analizy i obrazowania danych stosuje się kilka typów wykresów: – jednowymiarowe – dwuwymiarowe – perspektywiczne

Wykres jednowymiarowy – histogram - analizuje intensywność fluorescencji jednego parametru

Wykres dwuwymiarowy - kropkowy, gęstości (każda kropka reprezentuje pojedynczą komórkę) - analizuje intensywność fluorescencji dwóch parametrów

Wykres perspektywiczny (trójwymiarowy)

Parametry mierzone cytometrem przepływowym • Strukturalne – rozmiar – kształt – cytoplazmatyczne ziarnistości – zawartość barwnika np. hemoglobina, barwniki fotosyntetyczne, porfiryny – aminokwasy fluoryzujące w białkach np. tryptofan, tyrozyna – zawartość DNA, RNA, białek, lipidów, cukrów, powierzchniowych antygenów

Parametry mierzone cytometrem przepływowym • Funkcjonalne – ładunek powierzchniowy – ekspresję receptorów powierzchniowych – integralność błony (żywotność - apoptoza) – aktywność enzymów np. MPO

Kliniczne zastosowanie cytometrii przepływowej • Diagnostyka immunologiczna – – – niedobory odporności – pierwotne i wtórne diagnostyka alergii in vitro diagnostyka schorzeń autoimmunologicznych transplantologia narządowa i komórkowa ocena subpopulacji limfocytów ocena stanu funkcjonalnego komórek

Kliniczne zastosowanie cytometrii przepływowej • Diagnostyka hematologiczna • Diagnostyka onkohematologiczna – fenotypowanie komórek białaczkowych i chłoniakowych – analiza profilu DNA komórek nowotworowych – w trakcie chemioterapii – wykrywanie choroby resztkowej

Zalety • Jednoczesny pomiar wielu elementów tzw. „multiplexing” pojedynczych komórek • Analiza populacji na zasadzie cell-by-cell • Badanie całych komórek, jąder, mikrofragmentów komórkowych • Materiał badawczy – krew obwodowa, szpik kostny, węzeł chłonny, PMR, BAL, fragment tkanki • Oszczędność materiału • Analiza dużej populacji komórek (dane zbierane co najmniej dla 10. 000 komórek na próbkę) • Krótki czas analizy • Zastosowanie do analizy o różnym charakterze (diagnozowanie choroby, monitorowanie terapii)