Cytogenetik Cytogenetiske analyser banding teknik FISH og karyotype

Cytogenetik Cytogenetiske analyser (banding teknik, FISH) og karyotype Genvej til karyotyper Kromosomabnormaliteter (numeriske og Gå direkte til dette strukturelle) Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Cytogenetiske analyser: nogle indikationer • Diagnosticering af fænotypisk abnormalitet (fx hos nyfødt) • Risikovurdering af forældre til nyfødt med fænotypisk abnormalitet med henblik på senere graviditet • Prenatal diagnostik, herundersøgelse for Downs syndrom, samt undersøgelse for arvelige sygdomme som fx Di. George syndrom og Williams syndrom • Cancer; fx leukemier med henblik på klassifikation, prognose og behandlingsregime Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Cytogenetiske analyser: fakta om kromosomers opbygning og organisering, som udnyttes ved cytogenetisk analyse • Fakta: et kromosom består af et langt DNA molekyle (dobbelt strenget), som er oprullet omkring histoner og andre proteiner. (figur 2. 4 i Medical Genetics) → Kromosomer kan synliggøres/analyseres ved at benytte • farvning af DNA og/eller proteiner med histokemiske farvestoffer (herunder banding teknik) • mærkede DNA fragmenter (prober) som genkender og hybridiserer til komplementære sekvenser i kromosomets DNA streng (in situ hybridisering) • Fakta: kromosomerne er mere eller mindre kondenserede i løbet af cellecyklus. I mitosens metafase er kromosomerne maximalt kondenserede, og kan ses lysmikroskopisk ved HE farvning, mens de i interfasen cytologisk fremstår som eukromatin (lyse områder i kernen) og heterokromatin (mørke områder). I interfasen er de enkelte kromosomer dog lokaliserede i kerneområder. → Metafase kromosomer fra celler i deling kan anvendes til at beskrive en persons samlede kromosomudseende, kaldet karyotypen, mens interfasekromosomer kan anvendes til analyser, hvor man leder efter en bestemt mutation. Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Cytogenetiske metoder: Prøvemateriale (blod, væske og vævsprøver) Prøvematerialet • kan indeholde levende celler, som kan bringes til deling (fx blod, moderkagebiopsi) → metafase kromosomer kan frembringes • kan bestå af celler uden eller med insignifikant delingsevne (fx andre væv end blod samt fixeret væv) → celler er i interfase, og kun interfase kerner ses Se billeder www. cytochemistry. net Hvis du vil se flere metafasekromosomer (farvet med Giemsa), interfasekerner samt hetero- og eukromatin i interfasekerner kan du klikke her Billede fra ældre Abbotts præsentation: udlånt af U. Larsen, Abbotts Giemsa farvet præparat

Cytogenetiske analyser: Kort om fremstilling af metafase kromosomer • Vævsprøve med levende celler dyrkes i kultur 48 -72 timer (periferale leukocytter i blod), idet celledeling stimuleres med et mitogen (fx phytohæmaglutinin) • Cellernes metafase blokeres med fx colcemid, som hæmmer mitotisk spindle dannelse. • Cellerne(kernerne) høstes ved bl. a. centrifugering, og placeres på objektglas • Hypotonisk saltvand får kernemembranen til at sprænges, så metafasekromosomerne spredes på objektglasset, og under lufttørring bindes til objektglasset. • Kromosomerne visualiseres efter kromosom banding teknik eller FISH procedure, og fotograferes med henblik på karyotypering (karyotypebestemmelse) Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Cytogenetiske metoder: kort om kromosom banding teknik • • • Princip: forskellige områder af kromosomerne farves forskelligt af et givet farvestof, hvorved et karakteristisk båndmønster fremkommer på forskellige kromosom par. Ofte benyttes G banding, som fremkommer ved farvning med Giemsa farve efter trypsinbehandling (MG fig. 6. 3). Vha båndmønstre kan man identificere præcise dele af kromosomerne til brug ved karyotypering; fx 7 q 12. 2 (pil) Subbånd Bånd 3 2 1 2 2 1 5 4 3 2 1 1 2 p 1 1 q 2 1 2 3 4 1 1 2 3 Arm 1 1 2 3 1 Region 2 2 Kromosom 7; G banding teknik Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen Tilbage til karyotyper

Cytogenetiske analyser: karyotype og karyotypering • Karyotype: en ordnet præsentation af et individs metafase kromosomstruktur baseret på en celles metafasekromosomer arrangeret efter størrelse og centromér placering. Kønskromosomer placeres nederst til højre. (se MG fig. 8 -8, MD fig. 6. 1) • Karyotypering: navn for den proces, hvorved et individs karyotype fremkommer. Karyotypering kan ske på baggrund af kromosom banding teknik Til dette og/eller flourescens in situ hybridisering (FISH). Til dette • Karyotypen angives i henhold til international standard nomenklatur. Til start Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Cytogenetiske analyser: Karyotypering i praksis • 20 -30 metafaser tælles • 10 -25 af disse karyotyperes; dvs opsættes som vist i MG figure 6. 1 og figure 6. 7 • Kromosomerne tælles (parres) og båndene analyseres • Cytogenetisk diagnose afgives (ISCN) Figur fra Abbotts præsentation: udlånt af U. Larsen, Abbotts Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen Tilbage til strukturelle abnormiteter

Cytogenetiske analyser: International standard cytogenetisk nomenklatur(ISCN) • Se MD tabel 8. 3 for liste over forkortelser • Se MG tabel 6. 1 for eksempler • Generelt angives (Kromosom antal pr. celle), (kønskromosomer), (alle observerede abnomaliter) Se eksempler i MG figur 8 -10 og 8 -12, eller tag en slapper og leg lidt med karyotyper: karyotypering Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Cytogenetiske metoder: kort om flourescens in situ hybridisering (FISH) • Forskellige områder på et kromosompar eller forskellige kromosompar farves afhængigt af hvilken fluoroscerende probe, der vælges til hybridisering. Almindelige er: – Centromer prober (CEP) og telomer prober (TEP) (korte ~5 kb): hybridiser specifikt til henholdsvis centromeret og telomeren på et kromosom, og er kromosomspecifikt. – Locus specifkke prober: korte (60 -200 kb) prober, som genkender sekvenser i fx et gen – Kromosomprober: dækker hele kromosomer (prober op til 40 Mb) • Resultat af farvningen ses ved flourescensmikroskopi. Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Cytogenetiske teknikker: Sammenligning af Geimsa bånd og FISH signaler G-bånd LSI HER-2/neu CEP 17 Begge figurer fra Abbots præsentation om FISH; udlånt af U. Larsen. • Bemærk, at FISH kan anvendes diagnostisk på både interfasekerner og metafasekromosomer Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Cytogenetiske teknikker: Princippet bag FISH Figur lånt fra ældre Abbots præsentation; efter aftale Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen Tilbage til karyotyper

Kromosomabnormaliteter: typer og hyppighed • Abnormt kromosomantal (benævnes også genom mutationer eller numeriske abnormaliteter) eller • Abnorm kromosomstruktur (benævnes også kromosom mutationer eller strukturelle abnomaliteter) • Hyppigheder for nogle af disse ses i MG tabel 6. 2 Til start Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Kromosomabnormaliteter: Numeriske abnormaliteter • Normalt: - Euploid (2 x 23 i mennesket: 2 N), - Haploid (antal i kønsceller; 23 hos mennesket: N) • Abnormalt: - Polyploidy (3, 4, eller … x 23: fx 3 N) - Aneuploidy (færre eller flere kromosomer end et multiple af 23; fx 2 N-1 eller 2 N+1) Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Kromosomabnormaliteter: Numeriske abnormaliteter - aneuploidy • Oftest monosomi eller trisomi af ét kromosompar • Autosomer eller kønskromosomer monosomi: oftest letal i forstertilstanden 45, X (Turner syndrom) trisomi: især 47, +21; 47, +18; 47, +13 47, XXY; 47, XXX; 47 XYY • Skyldes oftest meiotisk nondisjunction, men kan også ske i mitosen Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Kromosomabnormaliteter: meiotisk nondisjunction Se MG figure 6. 6 • På venstre side sker nondisjunction i 1. meiotiske deling • Til højre sker nondisjunction i 2. meiotiske deling ▬► Dannelse af kønsceller, som ved befrugtning med en normal kønscelle vil resultere i monosomi eller trisomi hos afkommet Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Kromosomabnormaliteter: Screening for aneuploidy i fostervand, moderkagebiopsi eller blod 13 (green), 21 (red) disomy 13 X (green), Y (red) 18 (aqua) Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen trisomy 21 Billeder udlånt af overlæge Carsten Brandt

Kromosomabnormaliteter: strukturelle abnormaliteter • Typer: Se tidligere eksempel - Translokation (reciprok og i praksis robertsonsk) - Inversion Se IFISH detektion - Deletion - Duplikation - Ring kromosom - Translokation (ikke gensidig udveksling) Balanceret Ubalanceret • Årsager: upræcis parring af kromosomer i meiose samt kromosombrud i meiose og mitose (sker ofte i ”hot spots”) Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Kromosomabnormaliteter: Strukturelle abnormaliteter handler også om balance Balancerede Ex. MG figur 6. 14 og 6. 15 (6. 16) Ofte fuldt forenelige med et normalt voksenliv Abnormal kromosomparring i meiosen x ubalancerede Ex. Prader Willi syndrom Oftest altid forbundet med sygelighed, retardering og øget mortalitet Abnormal kromosomparring i meiosen Stor risiko for abnormale børn (MG 6. 14, 6. 16) Molekylærbiologi og genetik, 2008, S 4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen