Cuidado y manejo de animales para experimentacin Especies

Cuidado y manejo de animales para experimentación. Especies productivas. Campo Experimental-Instituto de Higiene-Facultad de Medicina DMV, MSc. Pablo Alonzo

Ley Nacional de Experimentación Animal Art. 2. Son consideradas como actividades de experimentación e investigación científica todas aquellas relacionadas con las ciencias básicas, ciencias aplicadas, desarrollo tecnológico y biotecnológico, producción y control de la calidad de drogas, medicamentos, alimentos, inmunobiológicos, dispositivos y/o instrumentos. No son consideradas como actividades de investigación las prácticas relacionadas con: A) la producción animal tales como: el anillado, el tatuaje, la marcación o la aplicación de otro método con finalidad de identificación del animal, que cause dolor leve o aflicción momentánea o daño pasajero y las intervenciones no-experimentales relacionadas a la misma. B) la salud animal tales como la profilaxis y el tratamiento veterinario. Art. 14. ”Se entiende por experimento a los procedimientos efectuados en animales vivos, buscando la elucidación de fenómenos fisiológicos o patológicos mediante técnicas específicas y preestablecidas”. .

Especies productivas Investigación BIOMÉDICA = o ≠ Investigación AGRARIA üSu utilización debe estar sujeto a las mismas consideraciones éticas que el uso de otros animales para el mismo propósito (Stricklin y col. , 1990). üCualquiera sea el tipo de investigación científica, científica se debe controlar la utilización de los animales y asegurar que tanto el dolor como el estrés sea reducido al mínimo (Guía para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio 1999). üEs el modelo planteado más que la categoría de investigación lo que determina las circunstancias en las que debe mantenerse la especie seleccionada (Guía para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio, 1999; www. nal. usda. gov).

Bienestar Animal Estado de salud mental y físico en armonía con el entorno o medio ambiente (Hugh, 1976). ". . incluye el alojamiento apropiado, el manejo, la alimentación, la prevención y tratamiento de enfermedades, el cuidado responsable, la manipulación humanitaria y cuando sea necesaria la eutanasia humanitaria” (Asociación Americana de Medicina Veterinaria, 2010).

“Las 5 libertades son pautas que deben regir el bienestar de los animales” (OIE, 2006) • Hambre y Sed. • Malestar físico y térmico. • Expresar el comportamiento normal. • Miedos y angustias. • Enfermedades, dolor e injurias.

Principios éticos para el bienestar durante el ensayo 1. Pensar en el mínimo de manipulaciones necesarias y las intervenciones en su entorno, evitando perturbarlo o provocarle reacciones de alerta o refugio. 2. Ofrecer un entorno confortable y protegido de agentes físicos, químicos y biológicos. 3. Lograr la seguridad del confinamiento, evitando su escape o fuga, la penetración de otros animales, la exposición a daños y la ausencia de peligros. 4. Áreas de alojamiento específicas para este propósito y responder a los requerimientos establecidos, para la especie y objetivo establecido. 5. Lograr los objetivos del experimento con el mínimo de variables y de animales. Alfonso ARC. ; Acta Bioethica 2007; 13(1)

Consideraciones para la selección del modelo • Considerar experimentos previos en especies menores. • Especie, raza, edad, sexo, estado fisiológico. • Fijar las condiciones de alojamiento y mantenimiento. • ¿Que cosas conozco de mi reactivo y cuales no? ¿Quién es el proveedor? • Que quiero medir y que factores pueden alterar mi ensayo. • ¿Cuento con las instalaciones apropiadas para el manejo y toma de muestras? • Criterios de punto final (poseer información). • ¿Como se realizará la eutanasia? • ¿Como manejamos los residuos generados por el ensayo?

¿En que debemos pensar? • Emplear animales sanos (mismo origen y categoría). • Conocer el manejo sanitario y alimentación previa. • ¿Que eventos sanitarios pueden alterar nuestro ensayo? • Realizar previo y durante el ensayo el examen clínico. • Implementar medidas de bioseguridad que protejan al hombre y al animal. • ¿Que residuos se van a generar? • Preveer un periodo de observación previo al ensayo.

Biología general del reactivo • • • Comportamiento Fisiología Nutrición Reproducción Manejo ? ? ?

Experimentación con Cerdos (Sus scrofa) Modelo animal para el hombre: • Sistema cardiovascular (conducción nerviosa, fisiología hemodinámica y electrocardiología, arterioesclerosis, infartos, anomalías congénitas). • Sistema gastrointestinal (odontología, toxicología, obesidad, úlceras gastroduodenales). • Dermatología (tránsito transcutáneo de medicamentos y cicatrización).

• Viven en grupos sociales con un marcado orden jerárquico. • En experimentación es mejor utilizar categorías jóvenes. • Conductas que reflejan aburrimiento o stress (se muerden la cola y las orejas o se lamen el ombligo). • Muy sensibles al estrés y a las corrientes de aire.

Macroambiente • Lechones en grupos y en corrales interiores con piso de rejilla, madera o material con paja. • Adultos temperatura ambiental 17 -24 ºC (humedad 40 -60%), lechones primer semana (30 -32 ºC). • Ventilación sin corrientes de aire. • Bebederos automáticos

Espacio físico recomendado para Cerdos Animal/Encierro Peso Corporal (Kg. ) Área de Piso/Animal (m 2) <15 Hasta 25 Hasta 50 Hasta 100 Hasta 200 >200 0. 7432 1. 1148 1. 3935 2. 2297 4. 4593 5. 5741 2 -5 <25 Hasta 50 Hasta 100 Hasta 200 >200 0. 5574 0. 9290 1. 8580 3. 7161 4. 8310 >5 <25 Hasta 50 Hasta 100 Hasta 200 >200 0. 5574 0. 8361 1. 6722 3. 3445 4. 4593 1

Experimentación con Bovinos (Bos taurus) • Investigación aplicada en ciencias agrarias. • Fisiología de la lactación. • Desarrollo del corazón artificial. • Producción de reactivos para investigación.

Experimentación con Bovinos (Campo Experimental) • Expediente Nº 071140 -000611 -10 "Identificación de antígenos de la glándula salival de H. irritans. Evaluación de los mismos como inmunógenos". • Expediente Nº 071140 -001676 -10 "Puesta a punto de pruebas de potencia de vacunas clostridiales de bovinos: Cl. Chaouvoei y Cl. Haemolyticum“. • Expediente Nº 071140 -000990 -11 "Estudio genómico de la respuesta temprana en los bovinos a la infección por Fasciola hepática". • Expediente Nº 071140 -001021 -11 "Fitoveterinarios antiparasitarios para especies productivas“. • Expediente Nº 071140 -001507 -11 "Estudio genómico de la respuesta temprana en los bovinos a la infección por Fasciola hepática“. • Expediente Nº 071140 -001814 -11 "Desarrollo de una vacuna recombinante contra Fasciola hepática en rumiantes".

Experimentación con Ovinos • Estudios de hemodinamia, modelo de glomerulonefritis primaria, estudios musculares (distrofia muscular hereditaria), EETs. Estudios de circulación cerebral (cabra), • Producción sangre para medios de cultivo microbiológicos. • Control de vacunas experimentales o comerciales (Clostridiales, Pasteurella, Fasciola hepática). • Investigación aplicada en ciencias agrarias.

Experimentación con Ovinos (Campo Experimental) • Expediente Nº 071140 -001462 -09 "Salmonella como vector para el desarrollo de vacunas de mucosas contra enfermedades priónicas". • Expediente Nº 071140 -000990 -11 "Estudio genómico de la respuesta temprana en los bovinos a la infección por Fasciola hepática". • Expediente Nº 071140 -001021 -11 "Fitoveterinarios antiparasitarios para especies productivas“. • Expediente Nº 071140 -000376 -11 "Evaluación clínica de dos nuevas vacunas anticlostridiales para el mercado internacional". • Expediente Nº 071140 -001814 -11 "Desarrollo de una vacuna recombinante contra Fasciola hepática en rumiantes".

Rumiantes (comportamiento) • Ovejas: son animales gregarios, se mantienen mejor sueltos y agrupados. • Cabras: forman grupos más reducidos o permanecen aisladas. • Bovinos: Animal de manada, sensibles a los sonidos agudos, campo visual amplio, tienden a moverse de áreas oscuras a las iluminadas. • Son asustadizos pero se acostumbran a las personas que las cuidan regularmente. • Los animales que tienen una buena experiencia previa de manejo serán más fáciles de manejar que aquellos que vienen de una historia de manejo rudo.

Rumiantes (comportamiento)

Experimentación con rumiantes (alojamiento) • Razas (biotipo lechero o carnicero). • Categorías. • Periodo de adaptación (mínimo de 15 días). • Valorar animales temperamentales o astados. • Preveer movilidad (ajustes de postura, acicalarse, echarse para la rumia). • Estabulado (box), semiestabulado (corral) o en condiciones extensivas (a campo).

Espacio físico recomendado para Ovinos (Ovis Aries) y Caprinos (Capra ircus) Animal/Encierro Peso Corporal (Kg) Área de Piso/Animal (m 2) 1 <25 Hasta 50 >50 b 0. 9290 1. 3935 1. 8580 2 -5 <25 Hasta 50 >50 b 0. 7897 1. 1613 1. 5794 >5 <25 Hasta 50 >50 b 0. 6968 1. 0498 1. 3935

Espacio físico recomendado para Bovinos Animal/Encierro 1 2 -5 >5 Peso Corporal (Kg) Área de Piso/Animal (m 2) <75 Hasta 200 Hasta 350 Hasta 500 Hasta 650 >650 2. 2297 4. 4593 6. 6890 8. 9187 11. 5110 13. 3780 <75 Hasta 200 Hasta 350 Hasta 500 Hasta 650 >650 1. 8580 3. 7161 5. 5742 7. 4322 9. 7548 11. 1483 <75 Hasta 200 Hasta 350 Hasta 500 Hasta 650 >650 1. 6722 3. 3445 5. 0167 6. 6890 8. 6310 10. 0335

Instalaciones y EPP

Estabulados o en box • Espacio físico. • Posibilidad de echarse 8 -12 hs. • Piso. • Cama. • Dieta (categoría, estado fisiológico). • Residuos. • Evitar alojar individual. • Manejo intrabox (personal). • Sanidad previa.

Estabulados o en box • Piso puede ser de rejilla o utilizar cama, que debe cambiarse frecuentemente. • Temperatura ambiente entre 10 y 24ºC (humedad relativa de 55 -75%), siempre y cuando no se expongan a extremos de radiación solar, humedad o vientos. • La ventilación de los boxes debe prevenir la acumulación de amoníaco y de gas metano producido en el rumen. • Control de consumo (observación 10 minutos luego de administración). • Bebederos automáticos. • Seguimiento de peso (ovinos).

Semiestabulados • Competencia (dominancia). • Instalaciones. • Espacio comederos y bebederos (distribución). • Piso. • Contaminación ambiente. • Protección (sol y lluvia). • Rotación de piquetes. • Piquete aislamiento. • Sanidad previa y durante. • Micotoxinas

En condiciones extensivas (a campo) • Linderos • Campo natural (oferta) • Mejoramientos (praderas, verdeos). • Suplementación (calidad, cantidad, presentación, proveedor, acopio, indigestiones). • Contaminación ambiente. • Fuente de agua natural (curso) • Protección de inclemencias. • Plantas tóxicas (Senecio, Mio, Transparente, Duraznillo negro y blanco). • Prever piquete de aislamiento.

Influencia del alojamiento • La ingestión de alimento y la ganancia/diaria disminuyó linealmente al aumentar el número de animales por cada espacio en el comedero de pienso durante la primera semana. • Acidosis subclínica aumenta linealmente con la competencia dentro del corral. • > porcentaje de abscesos hepáticos en el nivel más alto de competencia. González y col (2008). Journal Animal Science 86: 419 -431 González y col (2008). Journal Animal Science 86: 1446 -1458

Cuidado de la Sanidad en nuestro ensayo

¿Porque preocuparnos? • Afectan el bienestar • Algunas son zoonosis • Campañas sanitarias (impacto sobre el comercio) • Afectan los resultados experimentales

Salud vs. Enfermedad ≠ La separación entre enfermedad y salud no es absoluta, hay situaciones en las que puede ser difícil diferenciar lo normal de lo patológico.

Consideraciones sanitarias en el experimento • • • Especie? ? ? Categoría? ? ? Agente? ? ? Enfermedad? ? ? Prevalencia? ? ? Sistema productivo? ? ? Condiciones epidemiológicas? ? ? Herramientas de control? ? ? Infraestructura? ? ? Personal de apoyo? ? ?

Consideraciones sanitarias • Inspección y control de ecto y endoparásitos (antihelmínticos). • Prevención de enfermedades infecciosas de alta incidencia (Clostridiosis, IBR, DVB, Ectima contagioso), con potencial zoonótico (Carbunco, Leptospirosis, Tuberculosis) o bajo control oficial (Fiebre aftosa, Carbunco, Brucelosis). • Preveer protocolo de inspección clínica (diario o semanal) y las condiciones epidemiológicas en las cuales se desarrolla el ensayo. • Planificar la rutina de trabajo teniendo en cuenta que el personal de apoyo y todos los que tengan acceso a los animales pueden ser vehiculo de patógenos.

Impacto sobre nuestros resultados Tasa de concepción? ? ? Intervalo Interparto? ? ? Fertilidad? ? ? Tasa de retención de servicio? Efecto de la infección con Herpesvirus bovino 1 sobre el porcentaje de preñez de vacas de cría en Uruguay. Veterinaria (Montevideo) 48 (186) 5 -12 (2012).

Enfermedades Impacto sobre parasitarias nuestros resultados • Endoparásitos Nematodos • Disminución de la ingesta Cestodos • Pérdida de sangre y proteínas Trematodos • Trastornos en absorción de nutrientes (aumenta p. H) • • Prurito Pérdida de peso y crecimiento Disminución de la producción Transmisión de enfermedades Sarna • Ectoparásitos Piojo Miasis Moscas

Impacto sobre nuestros resultados Efecto de los nematodos gastrointestinales sobre diversos parámetros productivos del ovino en la etapa de recría. (1996) D. Castells, A. Nari, E. Rizzo, E. Marmol y D. Acosta • Respuesta a una vacuna? ? ? • Ganancia de peso? ? ? • Consumo? ? ? • Diferencias en la calidad de carcaza entre razas? ? ? • < Ganancia de peso • < Peso de Vellón • Largo de mecha • Diámetro de fibra • Parámetros productivos? ? ?

Impacto sobre nuestros resultados • Indicadores reproductivos? ? ? • Indicadores productivos? ? ?

Modelos en vacunas parasitarias • Protocolo CEUA/FM nº 071140 -000611 -10 "Identificación de antígenos de la glándula salival de H. irritans. Evaluación de los mismos como inmunógenos“. S. Rocha, P. Alonzo, M. Silva, X. Ures, L. Pastro, R. Alegre M. Breijo URBE/FM

Descripción breve del modelo • Reactivo empleado: bovinos cruza mayores de 2 años, sin tratamiento con productos insecticidas. Grupo de bovinos vacunados y controles sin vacunar. • Mantenimiento a campo y alimentación base pastoreo. • Toma de muestras para serología, evaluación de la carga parasitaria, captura de moscas para cuantificar Hemoglobina (indicador de cantidad de sangre ingerida por la mosca). • Asociar los niveles de anticuerpos en el huésped con la carga parasitaria presente y con la concentración de Hemoglobina presente en moscas.

Ig. G anti- PS titers (X 103) Haemoglobin per fly (µg/ml) Number of flies per animal Consideraciones del modelo A C B * E Weeks (0=vaccination) D F

Modelos en vacunas parasitarias • Protocolo CEUA/FM nº 071140 -000990 -11 "Estudio genómico de la respuesta temprana en los bovinos a la infección por Fasciola hepática". • Protocolo CEUA/FM nº 071140 -001507 -11 "Estudio genómico de la respuesta temprana en los bovinos a la infección por Fasciola hepática“. • Protocolo CEUA/FM nº 071140 -001814 -11 "Desarrollo de una vacuna 071140 -001814 -11 recombinante contra Fasciola hepática en rumiantes". • Protocolo CEUA/FM nº 071140 -002320 -12 - "Ensayo de una vacuna contra la fasciolosis bovina basada en leucina aminopeptidasa y catepsina B“. P. Alonzo, R. Alegre, M. López, G. Bottini, G. Magioli, C. Carmona Campo Experimental – UBP – Instituto de Higiene

Descripción breve del modelo • Reactivo empleado: 40 bovinos raza PH, 12 meses de edad, 180 -200 Kg, serológicamente negativos, coproantígeno y coproparasitario negativos, distribuidos al azar en 5 grupos. • Mantenimiento a campo en potrero aislado durante todo el ensayo. • Alimentación base pastoreo y suplementación con fardos, fuente de agua de bebedero. • Evaluación clínica general, seguimiento de peso mensual, toma de muestras para serología, materia fecal y valoración de enzimas de daño hepático. • Desafío con 400 -600 Metacercarias de F. hepática administradas por sondaje esofágico. • A las 10 semanas del desafío sacrificio en planta de faena, cosecha de los hígados y vesícula biliar, evaluación de carga parasitaria, tamaño de adultos, viabilidad, producción de huevos y peso del órgano.

Características del modelo

Características del modelo

Modelos en vacunas bacterianas Protocolo CEUA/FM nº 071140 -001676 -10 "Puesta a punto de pruebas de potencia de vacunas Clostridiales de bovinos: Cl. Chaouvoei y Cl. Haemolyticum“. P. Alonzo, M. Breijo, S. Rocha, R. Alegre, M. López, R. Pellegrino, L. Facal, J. Travers. Convenio URBE/FM- Merial S. A. Uruguay

Descripción breve del modelo • Reactivo empleado: 24 bovinos cruza de biotipo carnicero, 4 -5 meses de edad, serológicamente negativos y sin vacunación para la enfermedad a estudio. • Mantenimiento a campo en corral aislado durante la inmunización. • Alojamiento en box (15 días previos). • 8 bovinos empleados para ajustar dosis de desafío. • Evaluación clínica mínimo dos veces por día, toma de muestras para serología y valoración de enzimas de daño muscular. • Desafío con esporas de Cl. Chaouvoei y Cl. Haemolyticum en Ca. Cl 2 vía IM en zona posterior de masas musculares de la pierna. • Se valora sobrevida de animales vacunados y controles, score clínico y reaislamiento del agente de la zona de lesión.

Características del modelo

Características del modelo

Características del modelo

Protocolo de valoración clínica Fecha: Hora: Especificaciones: Identificación: Responsable: Mañana Tarde Temperatura Sensorio FC FR Mucosa ocular TLLC (seg. ) Reacción local (temperatura, tumoración, dolor y crepitación) Muestras de sangre para valorar enzimas de daño muscular (Aspartato aminotransferasa. AST y Creatin fosfoquinasa-CPK) al tiempo 0 y luego cada 12 -16 hs hasta finalizar ensayo.

Consideraciones clínicas (Reacción sistémica) Sensorio Normal 0 Deprimido 1 Muy deprimido y/o aumento del tiempo en decúbito costal 2 Auto auscultación y/o decúbito lateral permanente 3 Mucosas oculares Normal 0 Congestivas o pálidas 1 TLLC 1 a 2 segundos 0 3 o más 1 Hemoglobinuria No 0 Presencia 1 Temperatura Normal (hasta 39, 5) 0 1° C por encima de la media de los controles 1 > a 1° C por encima de la media de los controles 2

Consideraciones clínicas (Reacción local) Reacción local 0 1 2 Calor No Leve aumento Aumento notorio 3 Dolor No Solo a la palpación Profunda Tumoración No Zona inóculo hasta 10 cm de diámetro Edema No Presencia Pérdida de la función No Retira apoyo al movimiento Profunda y superficial Zona inóculo hasta 20 cm de diámetro Se suma crepitación No apoya en estación Miembro afectado hasta masas musculares de grupa y articulación del tarso.

Nuestro ensayo es un sistema RESULTADOS EXPERIMENTALES

“Respetar a los animales no usar; es valorar, comprender y estimar lo que se usa; y sobre todo, hacerse responsable de lo que se usa” Alfonso ARC (2007) Acta Bioethica; (13) 9 -15.