Cromatografa Tcnica bioqumica en la que sustancias mezcladas
Cromatografía Técnica bioquímica en la que sustancias mezcladas se separan en función de su carga, hidrofobicidad, tamaño o alguna otra propiedad, al repartirse entre una fase móvil y una fase estacionaria Muestra Eluyente aplicada Volumen de columna Matriz Tapón poroso Eluyente Proteínas separadas
ü Matriz de la columna: (Fase estacionaria o lecho de la columna). Matriz ó sustancia empaquetada en la columna que está empapada de solvente y que se. ü Fase Móvil. Solución tamponada que pasa a través de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna: Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad. ü Volumen de la columna. (Geométrico) Volumen total de la matriz ó gel que se empaqueta en una columna cromatográfica. ü Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente
Cromatografía de exclusión molecular ó filtración en gel PRINCIPIO: Separación en función del tamaño APLICACIONES Desalado de proteínas Purificación de proteínas Determinación de la masa molecular de proteínas TIPOS DE MATRIZ: Perlas de polímeros entrecruzados con poros de un tamaño determinado Dextranos entrecruzados Agarosa Poliacrilamida
Cromatografía de exclusión molecular ó filtración en gel PRINCIPIO: Tamaño de partícula y masa molecular. Mayor masa molecular eluye primero El gel retiene particuas de menor masa molecular
FASE ESTACIONARIA En esta práctica se utilizará el matriz-gel dextrano. Tipo Peso molecular Límite de fraccionamiento (daltons) Agua retenida (g/g gel sec) Volumen de gel hidratado (ml/g gel seco) G 10 Hasta 700 1. 0 2 G 15 Hasta 1500 1. 5 3 G 25 1000 - 5000 2. 5 5 G 50 1500 - 30 000 5. 0 10 G 75 3000 -80 000 7. 5 12 -15 G 100 4000 - 150000 10. 0 15 -20 G 150 5000 – 400 000 15. 0 20 -30 G 200 5000 – 800 000 20. 0 30 -40
Desventajas: No se pueden obtener fracciones de proteínas altamente purificadas si se parte de una mezcla compleja de proteínas
Fraccionar extractos proteicos Cromatograma Detección de proteína
Perfil de elución de extractos proteicos de 0, 12 y 24 h de germinación de maíz
Ejemplo: Mezcla de proteínas MW (k. Da) Conalbúmina + Feritina 75 440
FASE ESTACIONARIA En esta práctica se utilizará el matriz-gel dextrano. Tipo Peso molecular Límite de fraccionamiento (daltons) Agua retenida (g/g gel sec) Volumen de gel hidratado (ml/g gel seco) G 10 Hasta 700 1. 0 2 G 15 Hasta 1500 1. 5 3 G 25 1000 - 5000 2. 5 5 G 50 1500 - 30 000 5. 0 10 G 75 3000 -80 000 7. 5 12 -15 G 100 4000 - 150000 10. 0 15 -20 G 150 5000 – 400 000 15. 0 20 -30 G 200 5000 – 800 000 20. 0 30 -40
Ejemplo: Ferritina Proteína MW (k. Da) Conalbúmina 75 Ferritina 440 Na. Cl 0. 058 Conalbúmina Na. Cl
Ejemplo:
k. Da MASA Å TAMAÑO Å
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