CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN HPLC Licda Carol

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Licda. Carol Villatoro de Santistaban Análisis Instrumental Departamento de Fisicoquímica Escuela de Química USAC

¿Por qué? ● Cromatografía clásica ● Cromatografía instrumental ● Más: rapidez, resolución ● Menos: ensanchamiento de banda altura de plato teórico ● Automatización

INSTRUMENTACIÓN ● Fase estacionaria ● móvil ◦ Suministro de solventes ◦ Desgasificación ◦ Bombas ◦ Tubería ● ◦ Columna ◦ Horno Muestra ◦ Inyector ◦ Detector

Cromatógrafo básico

Suministro de solventes ● Solvente libre de partículas y de gases ● Filtración off-line y on-line ● Reservorios para varios solventes ● Programación solventes para mezcla de

Suministro de solventes

Desgasificadores ● Vacío ● Destilación ● Agitación con calentamiento ● Purga con gas inerte

Programador de gradiente ● Mezcla de solventes para gradiente ● Gradiente de alta presión ◦ Simple, pero caro ◦ Una bomba por solvente ◦ Volumen controlado por velocidad de bomba ● Gradiente de baja presión ◦ Barato ◦ Una sola bomba ◦ Volumen controlado por tiempo de apertura de válvulas

Programación en alta presión

Programación en baja presión

Bombas Altas presiones (>6000 psi) ● Libre de pulsaciones ● Amplio intervalo de caudal (0. 1 -10 ml/min) ● Reproducibilidad ● Resistencia a la corrosión ● Tipos ● ◦ Recíprocas ◦ De desplazamiento ◦ Neumáticas

Bomba neumática

Ventajas Desventajas Simple ● Barata ● Libre de impulsos ● ● ● Primera utilizada, todavía se usa para empacar columnas Capacidad limitada ● Caudal depende de viscosidad y presión de retorno ● Presión menor a 2000 psi ● Sólo condiciones isocráticas Bomba neumática

Bomba de desplazamiento

Ventajas Desventajas Flujo independiente de viscosidad y contrapresión ● Libre de pulsaciones ● ● Capacidad limitada ● Problemática para cambio de solventes ● Rellenado lento Bomba de desplazamiento

Bomba recíproca

Ventajas Desventajas Alta presión de salida ● Adaptable fácilmente a elución con gradiente ● Caudal independiente de viscosidad y contrapresión ● ● Flujo pulsado Bomba recíproca

Recíproca de un pistón

Recíproca de dos pistones

Tubería ● Ensanchamiento extra columna

Tubería

Columna

Horno

Inyección ● Características: ● Volumen pequeño (<500 µL) ● Sistema a alta presión ● Problemas de reproducibilidad ● Variabilidad de volúmenes ● Vulnerabilidad a abrasión

Inyección

Inyector ● Septum ● Resistencia a alta presión (10, 000 psi) ● Acero inoxidable ● Volumen fijo y constante (5 – 500 µL) ● Inyector de bucle

Inyector

FIN