Cristalografa de protenas na universidade de Santiago de

Cristalografía de proteínas na universidade de Santiago de Compostela. Mark J. van Raaij Departamento de Bioquímica e Bioloxía Molecular, facultade de Farmacia Unidade de Diffracción de Raios X, RIAIDT Universidade de Santiago de Compostela vanraaij@usc. es

- por que determinar estructuras de proteínas? - cristalización y cristalografía de macromoléculas - proteómica / genómica estructural - biología estructural de proteínas virales

por que determinar estructuras de proteínas? todavía no es posible predecir estructuras de proteínas la estructura de una proteína / macromolécula da pistas sobre su función, efecto de mutantes, etc. amino ácidos lejos en la secuencia primaria pueden estar muy cerca en 3 D para descubrir nuevos plegamientos, mejorar la predicción de estructuras

como determinar estructuras de proteínas? crio-microscopía electrónica. cristales 2 D: in membrano, proteínas de membrana. partículas simples - a resolución relativamente baja, apto para complejos grandes espectroscopía NMR - en solución - alta resolución - proteínas no muy grandes (< 30 k. D) difracción de fibras - p. ej. proteínas del músculo cristalografía de rayos X (neutrones)

cristalografía de rayos X - alta resolución, con datos (y fases) a ~ 3 Å de resolución o mejor se pueden construir modelos atómicos - apto desde moléculas pequeñas (Na. Cl) hasta muy grandes (ribosomas) - proporcionan una imagen estática de la estructura, aunque reacciones enzimáticas han sido estudiadas en cristales

pasos en la determinación de una estructura de una macromolécula • obtención de la macromolécula en escala de mg - expresión y purificación • cristalización - difusión de vapor, “micro-batch” • recogida de datos - ánodo rotante con detector, sincrotrón • determinación de fases - MR, MIR, SIRAS, MAD, SAD • análisis de la estructura • (verificación bioquímica de las conclusiones)

cristalización muestra - múltiples preparaciones de varios mg cada una a alta concentración (al menos 5 mg/ml, mejor 10 -20 mg/ml o más) - alta pureza, tanto “química” como “conformacional” estrategias de cristalización - en primera instancia probar ~100 condiciones muy diferentes - barrido de precipitantes vs p. H (4 -10) y temperatura (5 ºC y 20 ºC) - optimización de las condiciones más prometedoras (ajuste fino, aditivos) métodos de cristalización - difusión de vapor, “micro-batch”, otros

métodos de cristalización difusión de vapor: gotas colgantes, sentadas o “sandwich”

métodos de cristalización “micro-batch”: placas Terazaki, “gotas flotantes”

métodos de cristalización micro-diálise: “botones”

cristalografía de macromoléculas datos “nativos”: hasta varios cientos de imágenes como esta si se conoce una estructura relacionada (> 30% de identidad en secuencia), resolución de la estructura por “Molecular Replacement” (reemplazamiento molecular) puede ser posible (MR)

si no se conoce una estructura homóloga: MIR: Multiple Isomorphous Replacement, utilizando varios “derivados” de átomos pesados - importancia del isomorfismo, encontrar derivados útiles puede ser complicado SIR: MIR pero con un solo derivado, normalmente aprovechando la señal anómala (Anomalous Signal, SIRAS) MAD: Multi-wavelength Anomalous Dispersion, utilizando un derivado o una proteína modificada con Se-Met (ácido nucleíco con Br) SAD: Single-wavelength Anomalous Dispersion

cuellos de botella típicos - la proteína no expresa - la proteína se expresa de forma insoluble - la proteína es difícil de purificar - la proteína no cristaliza - los cristales obtenidos no difractan rayos X - no se encuentran derivados útiles duración típica de un proyecto: 3 meses - 3 años (o infinito)

proteómica / genómica estructural determinación de todas las estructuras 3 D de todas las proteínas de un determinado organismo (Homo sapiens, Mycobacterium tuberculosis) a diferencia de la biología estructural “tradicional”, determinación de estructuras de proteínas antes de saber su función clonaje, expresión, purificación y cristalización en paralela - economía de escala - tasa de éxito individual limitado: 10 -20%

proteómica / genómica estructural determinación de todas las estructuras 3 D de todas las proteínas de un determinado organismo (Homo sapiens, Mycobacterium tuberculosis) a diferencia de la biología estructural “tradicional”, determinación de estructuras de proteínas antes de saber su función clonaje, expresión, purificación y cristalización en paralela - economía de escala - tasa de éxito individual limitado: 10 -20% spin-off: tecnología como vectores de expresión, automatización, etc.

expresión, purificación cristalización recogida de datos resolución estructura año EMBL Grenoble, FR Leiden University, NL USC 2003 proteína de fusión IBS, Grenoble, fibritin / “foldon” FR IBS, Grenoble, FR USC 2004 “tailspike” del bacteriofago Det 7 Profos, Regensburg, DE USC USC 2004 proteína sigma. C del reovirus aviar USC USC 2005 cabeza fibra larga adenovirus aviar USC USC 2006 fibra corta del bacteriofago T 4

estructuras de fibras virales adenovirus reovirus aviar

morfología dominio de unión al virus dominio de unión al receptor - dominio central proporciona “alcance” - en general triméricas: - coiled coil - estructura beta proteínas estables (SDS, urea, temperatura, proteasas)

adenovirus - icosaédrico - caras : hexon, proteína trimérica - vertices: penton, base pentamérica, en el cual una fibra trimérica está insertada - cabeza de la fibra une receptor, en humanos CAR (Coxsackievirus and Adenovirus Receptor)

adenovirus aviar (CELO, FAV 1) - no es un patógeno importante, pero uso potencial como vacuna - dos fibras en cada base del penton: . fibra larga, no-esencial, receptor CAR? . fibra corta, esencial para infección in vitro, receptor desconocido

estructura de la cabeza de la fibra larga resuelta por SIRAS con derivado de cloruro de metilmercurio y refinado con datos nativos a 1. 6 Å de resolución en colaboración con Patrick Langlois, Ploufragan, Francia

cabeza de la fibra larga

AD 2 LFH . . . . ---A---. . . ----B-----. . ----C----. . ITIGNKNDDKLTLWT. TPDP. SPNCR. . . IHSDNDCKFTLVLTKCGSQVLATVAALAV 441. . . |. . . . PEVATYHCGDNLLESYDIFASLPNTNAAK. VAAYCRLAAAGGVVSGTIQVTS. 633. . . . d. . sp. . . k. . K. . . v. . . . ---D----. . . . . -E--. . F-. . . SGDLSSM. . . TGTVASVSIFLRFDQNGVLM. . ENSSLKKHYWNFRNGNSTNANPY 491. . . . . |. |. . . . . YAGRWPKVGNSVTDGIKFAIVVS. . PPMDKDPRSNLSQWLG. ATVF. . . . PAG 679 k. . . . . k. y. . n. . st. . . ---G---. . ---HTNAVGFMPNLLAY. . PKTQ. . . SQTAKNNIVSQVYLH. . . GDKTKPMILT 533. . . |. ||. . . |. ATTALFSPNPYGSLNTITTLPSIASDWYVPESNLVT. . YTKIHFKPTGSQQLQLASGELV 737. . . . P. p. . . . . ---I----. . . --J----. . . ITLNGTSESTETSEVSTYSMSFTWSW. . ESGKYT. . . TETFATNSYTFSYIAQE. 582. . . . |. |. . VAAA. . . KSPV. QTTKYELIYLGFTLKQNSSGTNFFDPNASSDLSFLTPPIPFTYLGYYQ 793. . . . alineamiento de las secuencias de las cabezas de la fibra del adenovirus humano tipo 2 (AD 2) y la fibra larga del adenovirus aviar basados en la estructura identifica pocos aminoácidos implicados en unión a CAR conservados

la fibra larga del adenovirus aviar probablemente no une CAR o lo hace de manera diferente que adenovirus humano rojo: cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar amarillo: cabeza de la fibra del adenovirus humano tipo 12 azul: dominio 1 de CAR

reovirus aviar - patógeno importante - genoma: 10 ds. RNAs - 8 proteínas estructurales y 4 noestructurales - cubierta interna: A, C - cubierta externa: C (fibra) - receptor desconocido C A C A en colaboración con Javier Benavente, USC

estructura del dominio C-terminal de sigma. C, el dominio de unión al receptor de la fibra del reovirus aviar - resuelto por MAD con derivado de cloruro de metilmercurio y refinado con datos nativos a 2. 1 Å de resolución - lamina beta circular DABC-HEFG con bucle DE largo - dos repeticiones de espiral beta triple

aminoácidos conservados en todas las cepas del reovirus aviar en la superficie del trímero

futuro recursos • cristalización de macromoléculas - robot de cristalización • plataforma de expresión y purificación de proteínas para estudios estructurales - bacterias - (baculovirus, levadura, células de mamífero) • clonaje en vectores de expresión paralelo investigación • cristalografía de proteínas (no solo virales) • proyecto EU Artizymes “desarrollo de metaloenzimas artificiales que contienen metales de transición” • proyecto EU Be. Natural “nano-materiales biotecnológicos para investigación y aplicaciones”

agradécese a colaboración de: • Lois Hermo, Pablo Guardado, Patricia Ferraces, Antonio Llamas • grupo de Javier Benavente e José Martinez-Costas • Gavin Fox, ESRF Spanish beamline BM 16 • unidade de difracción de raios X (RIAIDT) • financiamento: EU: proxectos Artizymes e Be. Natural MEC: BFU 2005 -02974, BFU 2005 -24982 -E (ESF: proxecto Fol. Pro. Com, Euro. SCOPE), HG 2005 -0012 (acción integrada Grecia) Xunta de Galicia: incentivo Artizymes, infraestructura (FPLC)