Cribado molecular de pacientes con sospecha clnica de
Cribado molecular de pacientes con sospecha clínica de Síndrome de Lynch. Estudio comparativo de dos métodos para análisis de inestabilidad de microsatélites (IMS). Javier Hernández-Losa 1, Stefania Landolfi 1, Allan González 2, Lluís Catasús 2, Carlos Parada 1, Miriam Cuatrecasas 3, Judith Balmaña 4 1, Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Valle de Hebrón. Universidad Autónoma de Barcelona. 2 Servicio de Anatomía Patológica Hospital de Sant Pau, Universidad Autónoma de Barcelona. 3 Servicio de Anatomía Patológica, Hospital Clínic, IDIBAPS, Universidad de Barcelona. 4 Servicio de Oncología del Hospital Universitario Valle de Hebrón. Universidad Autónoma de Barcelona
Título: Cribado molecular de pacientes con sospecha clínica de Síndrome de Lynch. Estudio comparativo de dos métodos para análisis de inestabilidad de microsatélites (IMS). Espectro de lesiones cancerosas en colon Mutación autosómica dominante en línea germinal de alguno de los genes implicados en MMR. h. MLH 1 , h. MSH 2, h. MSH 6 y PMS 2 Otros 1 HNPCC 1 FAP Familiar HNPCC o síndrome de Lynch: 5 25 68 tipo I : Afectación Colon tipo II: Afectación Ovario, endometrio, estómago, intestino delgado, páncreas, riñón y ureter. Esporádico Llompart A, Obrador A, Dolz C. Cáncer colorrectal hereditario. Gastroenterol y Hepatol 1992 ; vol 15 : 7 -13. Lynch HT, Smyrk T, Lanspa S, Lynch J. Colonoscopy in relation to the evolving genetics of familial colorrectal cancer. Endoscopy 1995 ; 27 : 43 -49
¿ Como detectar pacientes sugestivos de padecer HNPCC? Selección de pacientes para cribado molecular a) Criterios Clínicos: Amsterdam y Bethesda b) Criterios Anatomo-Patológicos: Localización, componente mucinoso, componente inflamatorio, células en anillo de sello, etc. . c) Creación de algoritmos predictivos Flujo de trabajo propuesto: 1) Historia Familiar de cada paciente 2) Análisis por IHQ de los genes reparadores (MLH 1, MSH 2, MSH 6 y PMS 2) 3) Análisis de Microsatélites (Panel referencia) 4. a) Análisis de mutaciones de BRAF o 4. b) Hipermetilación de promotor de MLH 1 a) Secuenciación del gen alterado por IHQ Cribado Eficiente Beneficio para el paciente Disminución angustia paciente Ahorro económico
Microsatélites: Secuencias cortas de DNA repetidas y localizadas a lo largo del genoma, generalmente repeticiones de Adeninas. (A)n , (AA)n, (AAA)n, etc…. La inestabilidad de microsatélites es un reflejo de una deficiencia en el sistema MMR Un 3% de Inestabilidad de microsatélites esta ligada al HNPCC Un 12% de Inestabilidad de microsatélites se da en los CCR esporádicos La inestabilidad de microsatélites, tiene papel pronóstico per se además de predecir respuesta a diferentes tratamientos quimioterápicos. Microsatelites usados para cribado de cancer colorectal Boland Goel A. Gastroenterology 2010; 138: 2073 -2087
Material y Metodos: 1. Selección de 105 pacientes con CCR, endometrio, ovario y gastrico, que cumplen con criterios clínicos de sospecha de HNPCC. (Amsterdam o Bethesda) 2. Estudio inmunohistoquímico h. MLH 1 (Clon G 168 -728 BD Bioscience), h. MSH 2 (Clon G 219 -1129 BD Bioscience) y h. MSH 6 (Clon 44 BD Bioscience). (PMS 2 en algunos de ellos) 3. Extracción de ADN correspondientes a a la zona normal y la zona tumoral de cada caso mediante EZ 1 DNA Tissue Kit (Qiagen). 4. Análisis de MSI de todos los DNAs con el panel de Promega Corp. 5. Envío de alícuotas de DNA codificadas para el análisis mediante Panel de Bethesda h. MLH 1 Normal Tumor h. MSH 2 Normal Tumor h. MSH 6 Normal Tumor
Material y Métodos: -Multiplex con diferentes fluorocromos vs PCR sencillas con FAM -Controles de calidad -Cantidades de ADN BAT 26 NR 21 PENTA-D BAT 25 MONO 27 NR 24 PENTA-C Normal BAT 26 NR 21 PENTA-D BAT 25 MONO 27 PENTA-C NR 24 Tumor Panel de Promega Corp. Panel de Bethesda.
Tabla descriptiva de la serie analizada Resultados: Comparativa MSI Bethesda vs Promega MSI Promega Comparativa MSI Bethesda vs Promega con IHQ MSI Bethesda Stable Low High Stable 69 13 8 Low High _ _ _ 15
Resultados: Estudios comparativos de las dos plataformas con la Inmunohistoquímica MSI Bethesda Inmunohistoquímica Presencia Ausencia Total Fila Negativo 81 (77%) 0 81 (77%) Positivo 8 (8%) 16 (15%) 24 (23%) Total Columna 89 (85%) 16 (15%) 105 MSI Promega Presencia Ausencia Total Fila Negativo 89 (85%) 1 (1%)* 90 (86%) Positivo 0 15 (14%) Total Columna 89 (85%) 16 (15%) 105 Prevalencia = 0. 1524 Sensibilidad = 1. 000 con IC 95% [0. 794, 1. 00] Especificidad =0. 9101 con IC 95% [ 0. 8305, 0. 964] Prevalencia = 0. 1524 Sensibilidad = 0. 9375 con IC al 95% [0. 697, 0. 9984] Especificidad = 1. 000 con IC al 95% [ 0. 954, 0. 964] Kappa de Cohen: 0. 7552 Estadistico de contraste z: -2. 8284 p-valor (bilateral) para kappa: 0. 002 E-3 Kappa de Cohen: 0. 9622 Estadistico de contraste z: 5. 7180 p-valor (bilateral) para kappa: 0. 0001 E-4 * Caso que presenta BRAF mutado en V 600 E
Resultados: Estudios comparativos de BAT 25/BAT 26 Kappa de Cohen: 0. 8992 Estadistico de contraste z: 5. 4885 p-valor (bilateral) para kappa: 0. 0004 E-4 Ambos casos fueron Positivos para el análisis por IHQ
Conclusiones: El análisis de MSI por el panel de Promega, posee mayores medidas de control de calidad así como una menor cantidad de ADN a consumir en las determinaciones El análisis de MSI por el panel de Promega, posee una mayor especificidad a la hora de seleccionar pacientes candidatos con sospecha clínica de HNPCC
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