Costruzione di librerie di c DNA Costruzione di

Costruzione di librerie di c. DNA

Costruzione di librerie di c. DNA - Lisi cellulare - Estrazione dell’RNA - Colonna cromatografica cellulosa con oligod. T

Costruzione di librerie di c. DNA Aggiunta di frammenti polylinker con siti per enzimi di restrizione per clonaggio in vettori plasmidici o di espressione

Costruzione di librerie di c. DNA

Costruzione di librerie di c. DNA - Rnasi H: frammenti di RNA non degradati come primer Oppure utilizzo di esameri random come primer - DNA pol I - ligasi - Polylinker con sito di clonaggio - Digestione enzimatica - Inserzione nel vettore + ligasi Es: libreria di c. DNA del grano

GENOMICA: studio del genoma nella sua interezza Come si ottiene la sequenza genomica completa di un organismo? La sequenza genomica è il punto di partenza di nuove analisi per lo studio della struttura, della funzione e dell’evoluzione sia dell’intero genoma che di sue porzioni I metodi di studio del genoma utilizzano: - la bioinformatica - la genomica comparativa - la genomica funzionale

COME SI OTTIENE LA SEQUENZA DI UN INTERO GENOMA? Due strategie: - assemblaggio di cloni genomici in contigui attraverso vari metodi, ricostruzione di una mappa lineare, sequenziamento dei cloni. - sequenziamento casuale di un enorme numero di cloni e loro assemblaggio in base alla sovrapposizione delle sequenze (WGS = Whole Genome Shotgun Sequencing).

Sequenziamento di cloni ordinati in contigui

WGS = Whole Genome Shotgun Sequencing Stringhe di 600 bp 10 letture indipendenti sequenza consensus di ogni specie

Metodo WGS e clonaggio in vettore con estremità note (Primer 1 e 2)

WGS – primer walking PCR o sequenziamento di frammenti non clonati PCR spazio breve

WGS = Whole Genome Shotgun Sequencing